污水中耐红霉素细菌的复活特性研究

2018-08-08汪喜生吕瑞滨沈怡雯郭美婷

安全与环境工程 2018年4期

汪喜生，吕瑞滨 ,沈怡雯,郭美婷

(1.上海城投污水处理有限公司石洞口污水处理厂，上海 200942 ；2.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092 )

耐抗生素类药物的滥用导致了环境中抗药性细菌广泛传播，目前在地表水、地下水、土壤等中均检测出多种抗生素耐药细菌或耐药基因[1-4]，因而普遍被认为是一种“新型污染物”[5]。病原菌之间耐药基因的传递已成为治疗相关疾病面临的最大困难之一[6]。城市市政污水经常接纳各种医疗废水和社区废水，因而也成为耐药细菌和耐药基因的重要储存地[7]。因此，控制和降低污水处理厂出水中细菌的耐药性水平，对降低其健康风险、提高污水再利用的安全性具有重要的意义。

消毒是污水处理厂处理流程的重要单元，也是再生水生产的必备单元。大量研究文献表明，污水处理厂常规处理工艺不能有效降低细菌的耐药性，因此消毒是控制和降低污水中微生物生态风险的关键手段[8-9]。紫外线(Ultraviolet,UV)消毒技术经过多年的发展已相对成熟，在高效地灭活微生物的同时，有害消毒副产物生成很少，具有高效性、安全性和经济性等特征[10]，其应用越来越广泛。目前对紫外线消毒过程对抗生素耐药细菌和耐药基因去除效果的研究已取得了一些进展。大部分研究表明，紫外线消毒具有较显著的杀灭耐药细菌和耐药基因的能力，但消毒剂量受污水水质、耐药细菌类型、接触条件等因素的影响，通常需要较高消毒剂量以获得较显著的去除效果。如McKinney等[8]研究了紫外线消毒对污水中4种耐药基因(mecA、vanA、tetA、ampC)的去除效果，结果发现：当消毒剂量为200～400 mJ/cm2时，耐药基因的去除率为3～4 log。

此外，实际污水处理厂中的紫外线消毒设备容易受到运行年限、更换周期等因素的影响，其对耐药细菌和耐药基因的去除效果存在不稳定性。由于不能提供持续的消毒效果，细菌复活现象也是削弱紫外线消毒杀菌效果的重要因素之一。已有研究学者对细菌复活的机理和影响因素等进行了研究。如Templeton等[11]研究指出，污水中的大肠杆菌和粪大肠杆菌会在照射过后的120 min内快速地复活;Auertbach等[12]列举出了可以光复活的细菌种类以及它们的复活机理，指出影响光复活的因素有光照条件、细菌类型和污水水质等；McKinney等[8]研究了来自于加拿大的一个污水处理厂出水中粪大肠杆菌的光复活效果，结果发现:经过3 h的太阳光照射后，其平均光复活率为1.2个对数级。但是现有的光复活研究大部分停留在普通细菌层面，对于抗生素耐药细菌光复活情况的研究较少涉及，而耐药细菌的复活程度将在很大程度上影响其后续耐药性风险和再利用安全性，因而有必要针对紫外线消毒过程中耐药细菌的复活特性展开调研。另外，根据相关文献研究，细菌在经过紫外线照射之后也会一定程度上发生暗复活现象，因此也有必要对不同复活方式细菌的复活情况展开进一步讨论。

红霉素在我国临床治疗等方面具有广泛的应用，其耐药细菌和耐药基因在污水处理厂污水中普遍被检出。本文拟以耐红霉素细菌作为研究对象，对典型的耐红霉素细菌经紫外线消毒后的复活特性展开试验研究，考察了消毒剂量、复活方式、复活强度等因素对耐红霉素细菌复活程度的影响。此外，为了评价复活强度的影响，对比了耐红霉素细菌的光复活和暗复活的复活情况；为了比较不同类型耐红霉素细菌的复活情况，选择耐红霉素异养菌、粪大肠菌群和单一大肠杆菌三类细菌作为研究对象，考察其在紫外线消毒处理过程中的复活特性，并评价了经紫外线消毒处理后红霉素耐药性的后续生态风险。

1 材料与方法

1.1 污水采集与耐红霉素细菌的筛选

本次试验所用污水取自上海市Q污水处理厂紫外线消毒前的水样(即新鲜污水)，并作为实验室紫外线消毒及后续复活的样品。该污水处理厂服务人口约20万人，主要进水为周边居民生活污水，处理规模为60 000 m3/d，主体工艺为A2/O(厌氧—缺氧—好氧)脱氮除磷工艺，水力停留时间为7.7 h；为了保障脱氮效果，在二沉池后又设置了曝气生物滤池，滤料负荷为0.35 kg NH3-N/(m3滤料·d)，处理后的污水采用紫外线消毒。将2 L水样收集于无菌聚乙烯取样瓶后，置于冰上储存并运回实验室立即进行后续试验。采集污水的常规水质指标见表1。

表1 试验所用污水的常规水质指标Table 1 Water quality indicators of wastewater for test

为了筛选耐红霉素大肠杆菌，先将上述新鲜污水经一系列梯度稀释后各取1 mL加入含红霉素(32 mg/L)的大肠杆菌选择性培养基(HB7001，海博生物，青岛)中，充分振荡混合，待冷却凝固后于37 ℃培养24 h，从中挑选2～3株菌株分别接种至1 mL液体LB培养基(NaCl 10g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，万古霉素32 mg/L，pH=7.2)中，于37℃150 r/min恒温培养24 h；再将菌液于LB培养基平板(含红霉素浓度为32 mg/L)进行划线分离后，挑取4～5株单菌落于液体LB培养基中，于37℃150 r/min恒温培养24 h；最后取1%的量将上述菌液扩培后分装于2 mL离心管中，加入甘油于-40℃保存。另取一管纯菌液送至上海杰李生物公司测序，鉴定发现菌株类型为大肠杆菌K12。

取冰冻保存的大肠杆菌K12菌液复苏，在10 000 r/min下离心10 min，弃上清液，用PBS缓冲溶液将沉淀重新悬浮，然后加入滤膜过滤后的污水处理厂二沉池出水，充分振荡后即为制备好的菌悬液。

1.2 紫外线消毒处理

在实验室采用低压紫外平行光仪作为紫外线消毒光源，光源功率为120 W(TL 120 W/01,Philips)，光束在样品表面中心位置的照射强度为0.17 mW/cm2，通过控制紫外线照射时间的长短来控制水样消毒剂量。根据Germicidal Fluence低压汞灯紫外线照射强度计算软件，可计算出特定水样在中心位置紫外线照射强度下消毒剂量与时间的关系[13]。参照实际污水处理厂紫外线消毒剂量，本试验设定紫外线消毒剂量分别为1 mJ/cm2、10 mJ/cm2，对实际污水和筛选的耐红霉素大肠杆菌K12样品在实验室进行了消毒试验。经紫外线消毒后的水样用于测定耐红霉素细菌的浓度。

1.3 复活处理

对紫外线消毒后的水样进行复活处理，复活处理分光复活、暗复活处理。其中，光复活处理是在实验室采用SPX-250B-G型微电脑光照培养箱作为光源，通过光强控制光复活剂量，在420 nm处光强分别为50 μW/cm2、20 μW/cm2和7.5 μW/cm2(UV-M型紫外辐照计)，取20 mL采集的水样放置于培养皿中，在室温(25℃)于不同光强照射下处理1 h之后进行取样，测定耐药细菌的浓度；暗复活处理是将采集的水样经紫外线消毒处理后，取20 mL于培养皿中用锡纸包好于室温(25℃)遮光处理4 h、24 h之后进行取样，测定耐药细菌的浓度。采用复活率评价细菌的复活情况，其计算公式为

(1)

式中：Np为复活后样品细菌计数(CFU/mL)；N为紫外消毒后样品细菌计数(CFU/mL)；N0为紫外消毒前样品细菌计数(CFU/mL)。

1.4 耐药细菌浓度的测定

本试验选取红霉素作为研究对象，检测耐红霉素异养菌、粪大肠菌群和大肠杆菌K12的浓度。

采用平板计数法进行耐红霉素异养菌浓度的测定，具体测定方法如下：先将样品在150 r/min摇床中振荡3 min以充分混合样品，取1 mL混合充分的样品进行10倍连续梯度稀释；再取1 mL以若干梯度稀释的样品分别置于皮氏培养皿，加入10 mL含8 mg/L红霉素的营养琼脂(蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L，pH=7.2)后充分摇荡以混合培养基和样品；待冷却凝固后将样品放入恒温培养箱中于37℃培养24 h，统计菌落数在20～300 CFU/mL的培养皿，确定耐红霉素异养菌的数目。每个梯度浓度的样品均设置3个平行样本。此外，将1 mL以同样梯度稀释的上述水样加入不含红霉素的营养培养基中进行培养计数操作，用来反映水样中的耐红霉素异养菌的总数。

耐红霉素大肠杆菌K12浓度的测定参照上述耐红霉素异养菌浓度的测定方法，不同之处只是将培养基换成培养大肠杆菌K12的LB培养基(酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂10 g/L，pH=7.2)。

采用滤膜法进行耐红霉素粪大肠菌群的测定，具体测定方法如下：将适量水样注入已灭菌的放有滤膜(孔径0.22 um)的过滤装置中，并将截留细菌的滤膜贴于浇注好的M-FC培养基(HB0154，青岛海博)上，在44.5℃温度下培养24 h，记录颜色为蓝色或蓝绿色且菌落数在5～60 CFU/mL的培养皿，从而计算出每1 L水样中含有耐红霉素粪大肠菌群的数目。

红霉素浓度值的选取依据为美国临床实验室标准化协会2011发布的耐药性标准CLSI(2011版)[14]中规定的各病原菌对该抗生素具有抗药性的最低抑菌浓度且取最大值。

2 结果与讨论

2.1 紫外线消毒剂量对耐红霉素细菌复活程度的影响

为了考察紫外线消毒剂量对耐红霉素细菌复活程度的影响，本试验采集Q污水处理厂二沉池出水水样对耐红霉素细菌进行紫外线消毒复活处理(光复活、暗复活处理)，得到不同紫外线消毒剂量下耐红霉素的异养菌、粪大肠菌群和大肠杆菌K12的复活率见表2。

表2 不同紫外线消毒剂量下3种耐红霉素细菌的复活率Table 2 Reactivation of three types of erythromycin resistant bacteria under different disinfection dosages

由表2可知：

(1) 对于耐红霉素异养菌，随着消毒剂量的提高，经紫外线消毒后细菌的复活率降低；对于不同复活条件下的耐红霉素异养菌，在较低紫外线消毒剂量(1 mJ/cm2)下细菌的复活率(6.15%～21.54%)明显高于较高紫外线消毒剂量(10 mJ/cm2)下细菌的复活率(0.18%～1.86%)。

(2) 对于耐红霉素大肠杆菌K12，与耐红霉素异养菌的复活趋势类似，随着消毒剂量的提高，紫外线消毒后细菌的复活率明显降低；对于不同复活条件下的耐红霉素大肠杆菌，在低紫外线消毒剂量(1 mJ/cm2)下细菌的复活率(3.61%～14.90%)明显高于较高紫外线消毒剂量(10 mJ/cm2)下细菌的复活率(0.13%～0.87%)。

(3) 对于不同紫外线消毒剂量下耐红霉素粪大肠菌群,其复活趋势(见表4)也与耐红霉素异养菌有相似之处，虽然总体复活水平不高，但均呈现出在较低紫外线消毒剂量(1 mJ/cm2)下细菌的复活率(1.02%～4.12%)明显高于较高紫外线消毒剂量(10 mJ/cm2)下细菌的复活率(0.3%～0.09%)；对于部分细菌的复活率为负的情况，可以认为紫外线消毒后短时间的暗复活处理并不足以使暂时失活的细菌复活。耐红霉素异养菌与耐红霉素粪大肠菌群在复活过程中表现出相似的趋势，即随着紫外线消毒剂量的提高，细菌的复活被明显抑制，这可能与细菌的复活机理有关。紫外线消毒机理是使得细菌DNA形成嘧啶二聚体从而无法进行蛋白质合成和复制的调控，而细菌复活机制是首先复活酶与嘧啶二聚体结合，由于高紫外线消毒剂量处理后细菌DNA结构被完全破坏，难以与复活酶结合，从而导致紫外线消毒剂量升高，细菌的复活程度降低。

2.2 复活条件对紫外线消毒后耐红霉素细菌复活的影响

为了考察不同复活条件(方式)对耐红霉素细菌复活程度的影响，本试验对紫外线消毒后耐红霉素的异养菌、粪大肠菌群和大肠杆菌K12在光复活、暗复活处理后的复活情况进行了研究，其试验结果见图1。

图1 复活条件对紫外线消毒后3种耐红霉素细菌复活程度的影响Fig.1 Reactivation of three types of erythromycin resistant bacteria after UV disinfection under different resuscitative modes

由图1可见：对于耐红霉素异养菌来说，光复活处理后细菌的复活率为6.1 %～21.4 %，而暗复活细菌的复活率维持在15.2 %左右；对于耐红霉素粪大肠菌群，光复活处理后细菌的平均复活率均要高于暗复活处理；对比两种典型的复活方式(光复活和暗复活)，在一定的紫外线消毒剂量下光复活处理后细菌的平均复活水平要高于暗复活处理；对于耐红霉素大肠杆菌K12来说，光复活处理后细菌的平均复活率(3.7 %～14.9 %)也要高于暗复活处理(3.6 %～3.9 %)。总体上看，耐红霉素细菌在光复活处理后的复活程度要普遍高于暗复活处理，这可能是因为在紫外线消毒后细菌复活是由光照催化进行的，因而在光照条件下细菌的复活情况会比黑暗条件下更为显著。因此，对于污水处理厂污水经紫外线消毒处理后，耐红霉素细菌的光复活现象会在一定程度上增加生态风险，应引起重视。

2.3 复活强度对紫外线消毒后耐红霉素细菌复活程度的影响

本试验还对紫外线消毒处理后光复活和暗复活强度对耐红霉素细菌复活程度的影响进行了研究，结果发现：对于耐红霉素异养菌和耐红霉素大肠杆菌K12而言，在光复活处理的条件下，随着光照强度的增强，细菌的复活程度不断提高；而对于耐红霉素粪大肠菌群而言，随着光照强度的增强，细菌的复活率出现降低的趋势，表明细菌的复活程度被抑制。这可能是由于细菌光复活过程是由光照催化发生，因此随着光照强度的增强耐红霉素异养菌和耐红霉素大肠杆菌K12的光复活程度也不断提高；但对于耐红霉素粪大肠菌群而言，由于粪大肠菌群主要生活在人畜肠道内部，长期的黑暗环境生活使其对于光照较为敏感，较高的光照强度可能会抑制粪大肠菌群的生长。

对于耐红霉素的异养菌、粪大肠菌群和大肠杆菌K12而言，其暗复活程度都随着复活时间的延长而不断增强，这说明在没有光照催化的情况下，延长复活时间会促进耐药细菌更为显著的复活，因此对于污水处理厂出水进入管网之后，较长的复活时间会使得耐红霉素细菌的生态风险增大。

已有研究表明，紫外线消毒后细菌复活分两个阶段[15]：①复活酶与嘧啶二聚体形成络合物，此反应不需光照参加；②在光照催化下，嘧啶二聚体解聚恢复生物活性，复活酶脱落与其他嘧啶二聚体结合。当紫外线消素剂量较高时，细菌的DNA结构被完全破坏，复活酶难以与嘧淀二聚体结合，因而高剂量紫外线消毒后细菌的复活程度很低。由于光催化加速了反应进程，因此相较于暗复活，细菌的光复活程度更为明显。对于耐红霉素异养菌和大肠杆菌K12，随着光照强度的增强催化速率不断提升，使得细菌复活程度随光照增强更为显著；对于耐红霉素粪大肠菌群，由于其多数处在人畜肠道黑暗的环境中，高光强对其生长有一定的抑制作用，因此强光情况下会抑制其复活情况。

对比研究耐红霉素异养菌与耐红霉素粪大肠菌群中细菌的复活特性可知，当紫外线消毒剂量为10 mJ/cm2时，耐红霉素细菌基本没有复活，说明耐红霉素细菌中并不存在对紫外线消毒有强烈抗性的细菌种类。然而一般实际污水处理厂的紫外线消毒剂量常常低于5 mJ/cm2，甚至在1～2 mJ/cm2左右，此时经紫外线消毒后耐红霉素细菌的复活情况较为明显，因此低紫外线消毒剂量下耐红霉素细菌的后续生态风险需要引起关注。

2.4 对耐红霉素细菌复活的生态风险控制

为了考察耐红霉素细菌在紫外线消毒处理后复活时的生态风险，对上述试验得到的耐红霉素细菌复活情况数据进行了整理分析，结果显示：实验室中紫外线消毒(剂量为1 mJ/cm2)处理后耐红霉素细菌均出现较为显著的复活情况，而实际污水处理厂的紫外线消毒剂量普遍不高(1 mJ/cm2左右)，说明污水处理厂经紫外线消毒处理后的耐红霉素细菌的生态风险有一定的增加。其中，对于耐红霉素异养菌，高光强的光复活会很大程度地增加其生态风险；对于耐红霉素粪大肠菌群，低光强的光复活对其生态风险增加的影响最大。而对于耐红霉素细菌的暗复活，长时间的暗复活处理也会使耐红霉素细菌的复活程度更为明显，提升其相应的生态风险。

上述研究结果表明耐红霉素细菌在经过紫外线消毒处理后会出现一定的复活情况，这种复活情况以及受相应影响因素的变化与紫外线消毒后细菌的复活机制有一定的联系，光照催化复活反应使得细菌复活随光照增强更为显著。本研究以红霉素为例，考察了其耐药细菌的复活特性，结果表明：10 mJ/cm2以上的紫外线消毒剂量可以有效地控制耐药细菌的复活情况，但降低紫外线消毒剂量则会出现较为显著的细菌复活情况，其中以光复活为主，耐药细菌的生态风险反而有所增加[16]。实际污水处理厂运行期间，尤其是当紫外线消毒设备运行年限较长时，其有效照射剂量一般低于5 mJ/cm2，此时耐药细菌的生态风险需要引起重视。