噬菌体展示技术在单克隆人源单链抗体领域的研究进展

夏 静

(江苏省南京师范大学附属实验学校 210000)

1 传统单克隆抗体制备技术

1.1 抗体 抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。其单体结构呈“Y”字型，含有四条多肽链。其中，分子量较大的两条链称为重链，而分子量较小的两条链称为轻链。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，称为可变区(V)，靠近C端的氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(C)[1]。抗体的特异性识别和抗原结合能力主要取决于V区的氨基酸序列。

1.2 抗原决定簇 抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团称为抗原表位或抗原决定簇。表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区域，而一个抗原大分子往往具有多个不同的抗原表位。在最初依靠免疫小鼠、兔、羊等动物获得的抗血清，其主要免疫活性成分是多克隆抗体，即由多个浆细胞克隆产生的、针对多种抗原表位的抗体。

1.3 单克隆抗体 制备特异性抗体的理想方法是获得只针对单一表位的B细胞克隆，并在体外扩增，使其分泌抗体，然而浆细胞在体外培养寿命较短。1975年，Kohler和Milstein建立的体外细胞融合技术，获得了免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，克服了以上缺陷。杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，在结构和组成上高度均一(含有完全相同的重链和轻链)，抗原特异性一致，易于体外大量制备和纯化。因此，单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高等特性，已广泛应用于疾病的诊断、特异性抗原的鉴定、生物靶向药物的制备等领域[2]。

然而，传统单克隆抗体技术制备的抗体是小鼠源性抗体，用于人体进行治疗时，将作为抗原性蛋白引起人抗小鼠抗体反应，不仅使治疗性单克隆抗体半衰期变短，疗效减弱，有时还会引起严重的不良反应[2]。

2 噬菌体展示技术在人源单克隆抗体领域的运用

随着重组DNA技术的发展，包括噬菌体展示技术在内的各种抗体人源化基因工程技术的迅速发展，单克隆抗体药物经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段，使全人源单抗(其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用)的产生成为可能。2003年，针对人肿瘤坏死因子(TNF)的第一个全人源抗体阿达木单抗(Adalimumab)上市，可用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎等疾病。

2.1 何谓噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体衣壳蛋白基因相连，使多肽或蛋白质与其衣壳蛋白氨基端融合并展示在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。在此基础上建立的噬菌体展示抗体库，由于在重组载体构建中，不同DNA序列的重链基因与不同DNA序列的轻链基因随机组合，可以形成比实体B细胞内还要多的组合形式，其筛选范围较杂交瘤技术扩大了几千到几百万甚至几亿倍。因此，理论上可以从文库中筛选到针对任何抗原的高亲和力人源抗体，并且制备周期相对传统单抗大为缩短。

2.2 常用的噬菌体类型 噬菌体展示技术常用的噬菌体类型为：单链丝状噬菌体(如M13噬菌体)、λ噬菌体和T4噬菌体，目前在抗体领域应用最多的是M13噬菌体。M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，基因组可编码3类蛋白质，即复制蛋白、形态发生蛋白和结构蛋白。

2.3 噬菌体展示技术及其筛选流程 在基因工程抗体的研究中，研究者常将抗体片断与M13噬菌体尾部的结构蛋白——pⅢ融合表达而展示于噬菌体表面(图1)，通常抗体在噬菌体上呈3～5个拷贝展示。由于噬菌体基因组大小的限制，插入外源基因的大小最多1500bp。因此，目前以含有抗体重链和轻链可变区的单链(single chain fragment variable， scFv)抗体的研究最为常见。scFv抗体的相对分子质量约为25kDa，与完整抗体(分子量约为150kDa)相比，具有体积小、穿透性好等特点，能够到达深层靶组织，在疾病治疗应用方面有独特的优势。同时由于其分子量小，可以在人体内较快被降解代谢，故毒副作用较小。

图1 M13噬菌体

噬菌体展示技术筛选抗体的流程为：①将106～1011scFv-M13噬菌体克隆与固相化的抗原结合；②洗涤去除低亲和力的scFv-M13噬菌体克隆；③洗脱与抗原特异性结合的高亲和scFv-M13噬菌体克隆；④高亲和噬菌体克隆侵染宿主菌；⑤扩增高亲和scFv-M13噬菌体克隆。以上5步骤需循环3～5次以获得高亲和力的scFv单抗[3]。

2.4 建立噬菌体单链抗体文库 噬菌体单链抗体文库是将通过PCR技术克隆出的全套人抗体重链和轻链V区基因，在噬菌体表面进行展示。在构建噬菌体人源scFv抗体文库时，首先需要从人B淋巴细胞中提取RNA，并以此逆转录获得cDNA，接着用特异性引物分别扩增重链可变区和轻链可变区基因，通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将两段基因以一段连接序列相连，获得scFv基因。将scFv与噬菌体载体经过酶切、酶连后，获得重组噬菌体载体，侵染宿主菌扩增后即获得噬菌体scFv文库(图2)[4]。scFv在体外适宜的条件下，可以自发折叠成天然构象，保持重链可变区和轻链可变区的特异性结合能力。

图2 噬菌体展示scFv抗体文库的重组载体构建流程

2.5 scFv抗体的应用 目前已有大量关于scFv抗体应用于人体疾病治疗及诊断领域的研究报道。例如，马帕木单抗(Mapatumumab)是现今临床筛查和治疗DR4分子阳性肿瘤的有力武器，在单独运用以及与化疗药物联用的临床试验中都取得了良好疗效；在淋巴癌及多种实体瘤的临床研究中，已证明抗DR-5的Tigatuzumab其毒副作用小，穿透性强，治疗组相比对照组有明显延长患者生存期的效果[5]。治疗性单克隆除scFv抗体外，与其具有相似功效的还包括 Conatumumab(AMG 655)、Lexatumumab和Drozitumab等[6]。