来氟米特联合羟氯喹治疗对类风湿关节炎患者外周血IL—17、IL—23、TGF—β表达的影响

黄彩红 王小超

【摘要】 目的 研究来氟米特联合羟氯喹治疗类风湿关节炎（RA）患者外周血中白细胞介素（IL）-17、IL-23、转化生长因子β（TGF-β）的表达及临床意义。

方法 选取2015年10月～2017年10月确诊的初诊RA患者50例为观察组，选取50例在门诊体检中心健康体检者为健康对照组。所有患者均给予口服来氟米特联合硫酸羟氯喹治疗，观察3个月。治疗前1天及治疗后第3个月收集患者血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子IL-17、IL-23、TGF-β的表达水平，同时收集患者血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF），并记录肿胀关节数（SJC）、压痛关节数（TJC）等临床资料。分析比较两组间IL-17、IL-23、TGF-β表达水平的差异，研究来氟米特联合羟氯喹治疗RA患者前后免疫细胞因子的变化特点，探讨其可能的作用机制。结果 RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。经治疗3个月后，RA患者外周血IL-17、IL-23、TGF-β的表达水平与治疗前相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。RA患者外周血中ESR、CRP、RF明显高于健康对照组（P<0.05）；治疗后其水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），关节疼痛数、关节肿胀数与治疗前比较明显降低（P<0.05）。结论 RA患者外周血IL-17、IL-23、TGF-β的表达水平高于正常人群，经来氟米特联合羟氯喹治疗3个月后，其表達水平明显下降，且临床观察指标也明显降低，提示来氟米特联合羟氯喹治疗可缓解RA的临床症状，同时可降低IL-17、IL-23、TGF-β细胞因子的表达水平。

【关键词】 来氟米特；羟氯喹；类风湿关节炎；白细胞介素-17；白细胞介素-23；转化生长因子β

中图分类号： R593.22 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.005

【Abstract】 Objective To study the expression and clinical significance of leflunomide combined with hydroxychloroquine in peripheral blood interleukin-17 （IL-17），interleukin -23 （IL-23） and transforming growth factor β （TGF-β） in patients with rheumatoid arthritis（RA）.Methods 50 patients with newly diagnosed RA from October 2015 to October 2017 were selected as observation group，and 50 cases from the medical check-up center of our hospital were selected as control group.All patients were treated with leflunomide combined with hydroxychloroquine sulfate for 3 months.The serum levels of the patients were collected 1 day before treatment and at the third month after treatment.The expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.Meanwhile，erythrocyte sedimentation rate （ESR），C-reactive protein （CRP） and rheumatoid factor （RF） of the patients were collected，and clinical data like swollen joint count （SJC） and tender joint count（TJC） were recorded.The expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β between the two groups were analyzed and compared，the changes of immune cytokines in RA patients before and after treatment with leflunomide combined with hydroxychloroquine were studied，and its possible mechanism action was explored.Results The levels of IL-17，IL-23 and TGF-β in peripheral blood of RA patients were significantly higher than those in the control group，difference was statistically significant（P<0.05）.After 3 months of treatment，the expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β in peripheral blood of RA patients were significantly lower than those before treatment，and the difference was statistically significant（P<0.05）.The ESR，CRP and RF in peripheral blood of RA patients were significantly higher than those in the control group（P<0.05），and the above-mentioned levels of the patients were significantly lower after treatment，the difference was statistically significant（P<0.05）.The number of joint pain and joint swelling significantly reduced compared with those before treatment（P<0.05）.Conclusion The expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β in the peripheral blood of RA patients are higher than those of healthy people.After 3 months of treatment with leflunomide combined with hydroxychloroquine，the expression levels obviously decrease，and the clinical observation indexes also significantly decrease.These results suggest that leflunomide combined with hydroxychloroquine can relieve the clinical symptoms of RA and decrease the expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β cytokines.

【Key words】 leflunomide；hydroxychloroquine；RA；IL-17；IL-23；TGF-β

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）的主要临床表现为对称性侵蚀性多关节炎，为常见的慢性、全身性自身免疫病[1]。目前许多研究认为，自身免疫反应及众多细胞和细胞因子在RA的发病过程中起着非常重要的作用。研究表明，白细胞介素（IL）-17、IL-23、转化生长因子β（TGF-β）与RA的发病密切相关[2～3]。研究证实，甲氨蝶呤被认为是传统有效的抗风湿药物之一，但由于其不良反应多而常使患者被迫停药，不能耐受，临床上使用有一定的局限性。来氟米特（leflunomid，LEF）及羟氯喹（hydroxychloroquin，HCQ）是近年来我国新上市的新型免疫抑制剂，其用于治疗RA的安全性相对于甲氨蝶呤要好，不良反应少，已被广泛用于RA等自身免疫性疾病。其在RA的疗效研究备受关注，但对RA患者细胞因子的作用研究甚少，本研究通过采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测来氟米特联合羟氯喹对RA患者治疗前后IL-17、IL-23、TGF-β细胞因子水平变化及评估各项临床试验指標的影响，为RA的治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年10月～2017年10月在右江民族医学院附属医院风湿免疫科门诊就诊及住院治疗的初诊RA患者50例为观察组，均符合1987年美国风湿病学学会（ACR）类风湿关节炎分类标准[4]，排除患有心、肝、肾基础疾病，恶性肿瘤、严重感染、感染性疾病及合并有其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、系统性硬化症等患者。男16例，女34例，年龄19～66岁，平均（48.0±8.4）岁。病程2～96个月，中位病程30个月。选取在我院体检中心体检的健康者50例为健康对照组，其中男22例，女28例，年龄18～62岁，平均（44.6±10.4）岁。两组的性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有患者给予口服来氟米特片（亚邦药业，国药准字：H20080420，10 mg×10片/盒）前3天50 mg，每天一次，之后为20 mg，每天一次，联合硫酸羟氯喹片（上海上药中西制药有限公司，国药准字：H19990263，0.1 g×14片/盒）0.2 g，每天两次，观察3个月。且前3个月内未使用抗风湿药（DMARDs），在治疗过程中可适当加用小剂量糖皮质激素（泼尼松≤10 mg/d）或非甾体解热镇痛（NSAIDs），观察期间基本治疗方案不变。收集健康者及患者治疗前1天和治疗后第3个月的外周血，分离血清，采用ELISA检测免疫细胞因子IL-17、IL-23、TGF-β的表达水平，严格按照试剂说明书进行操作。

1.3 观察指标

收集患者血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）及记录肿胀关节数（SJC）、压痛关节数（TJC）等临床资料。

1.4 统计学方法

使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，各组之间比较采用两独立样本t检验，配对资料使用配对t检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 RA患者与健康对照组外周血中细胞因子水平比较

治疗前RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β的表达水平与健康对照组相比显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）；治疗后RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β的水平与治疗前比较明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 RA患者实验室及临床指标变化情况

治疗前RA组ESR、CRP、RF水平与对照组相比明显升高（P<0.01）；治疗后患者ESR、CRP、RF及关节疼痛数、关节肿胀数明显下降（P<0.05），提示治疗后病情有所缓解。见表2。

3 讨论

RA是较为常见的全身自身免疫性疾病，临床表现为对称性关节炎、关节破坏，基本病理改变为滑膜增殖血管翳形成，对关节和软骨侵蚀破坏，最终致使关节强直、关节功能丧失及畸形，致残率很高，对人们的生活质量产生严重影响。

目前类风湿关节炎的发病机制尚不明确，较多的研究认为是由多种因素共同作用的结果，如环境因素、遗传易感因素、免疫功能失调等，其中T细胞免疫调节异常是其发病、发展的关键因素[5]。辅助性T细胞（Th）根据其产生细胞因子种类不同，分为4个亚群：Th1，Th2，Treg和Th17。目前许多研究认为，Th17/Treg细胞及相关因子在RA的发病过程中起着非常重要的作用。Th17是近期研究发现的一种新型CD4+T细胞亚群，其特异性分泌IL-17而得名[6]，除了IL-17外，其还分泌其他细胞因子。近年来Th17及相关因子IL-17在RA的发生、发展中的作用备受关注。研究发现[7]，在RA患者关节液中IL-17表达增高，可能是其作用于骨及软骨，并可以促进滑膜血管增生和血管翳形成，从而诱发骨滑膜炎症、骨和关节损伤。近年文献报道[8～9]，IL-23是IL-17直接有力的调节因子，它由活化的树突细胞和巨噬细胞产生，主要在维持Th17细胞活化、分泌和记忆T细胞增殖方面发挥重要作用，且可以促进Th17细胞产生IL-17。有学者在IL-23与RA相关性研究发现，IL-23为一种促炎因子，可作为患者活动性参考指标，且参与RA骨破坏机制[10]。TGF-β与IL-6在Th17的分化过程中起重要作用，IL-6与TGF-β同时存在可促进Th17的分化，TGF-β单独存在可促使T细胞向Treg分化[11]。TGF-β是一种双向性、多效性的网络性细胞因子，既可以促进炎症作用，又具有抑制炎症活性作用。新近研究表明[12]，RA患者体内TGF-β水平显著降低，且活动期改变更显著，认为TGF-β在RA发病过程中主要发挥负性调节作用，抑制病变的进展。而我们的前期课题组成员研究发现[13]，活动期RA患者血清TGF-β水平表达显著高于健康者及RA非活动期患者，其在RA的发病中发挥正面的调控作用。本研究结果显示活动期RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β表达水平明显高于健康对照组，与上述研究一致，进一步证实了这些细胞因子与RA的发病密切相关。

RF是IgG分子Fc片段上抗原表位的特异抗体，在RA中阳性率为60%～80%，约10%的正常人一样可检测到，RF在RA的诊断中有重要意义。CRP是一种急性时相反应蛋白，可在炎症、组织损伤、肿瘤或感染时由肝细胞产生，在早期有较高的表达。ESR加快一般在关节及邻近组织的炎症反应发生，在一定程度上可反映病情活动及严重性，因此可用于观察RA病情变化及治疗效果。本实验结果显示，治疗后患者上述指标表达及临床指标如关节肿胀数、关节疼痛数明显降低，由此推测来氟米特联合羟氯喹治疗RA可缓解患者病情。

由于RA患者早期可出现关节的破坏，未及时治疗可导致关节严重畸形，致残率高，严重影响人们的生活质量，因此，早期诊断及早期治疗至关重要。目前对于RA的治疗主要为缓解症状、保护和恢复关节功能，抗风湿类药物联合治疗仍是目前主要治疗方式，传统的抗风湿治疗副作用大，并未达到人们预期的效果，因此，探索安全、有效的联合方案具有重要意义。甲氨蝶呤为传统的抗风湿药之一，其作用机制主要通过抑制二氢叶酸还原酶形成，影响核酸的形成而使细胞DNA合成障碍，从而抑制细胞生长，此外还有抗炎和抗免疫作用。国内有学者研究表明[14～15]，甲氨蝶呤作为多年来治疗类风湿关节炎最基础有效的改善病情药物，但也是细胞毒性药物，在体内累积到一定剂量时可产生严重的毒性反应，如骨髓抑制、胃肠道反应等，使得不少RA患者不能长期耐受。而来氟米特和羟氯喹是近年来我国新上市的新型免疫抑制剂，已被广泛用于类风湿关节炎等风湿免疫性疾病的治疗[16～17]。来氟米特主要是通过抑制二氢乳清酸脱氢酶的活性，阻碍DNA和RNA合成，抑制活化淋巴的生长，还可通过抑制酪酸激酶活化而影响淋巴细胞激活及增殖，是具有抗增殖活性的异唑类免疫调节剂。硫酸羟氯喹作为一种4-氨基喹啉类的抗疟药，其主要通过阻止炎症细胞因子释放白细胞介素及抑制抗原提呈细胞的功能，同时还可抑制溶酶体释放，抑制吞噬细胞趋化及吞噬功能，抑制成纤维细胞及淋巴细胞的增殖，从而减轻局部炎症反应及关节症状，减少关节畸形的发生。近年来学者研究表明[18]，来氟米特和羟氯喹在治疗类风湿关节炎中不良反应少、耐受性好。其在治疗类风湿关节炎疗效观察研究备受关注，但其对细胞因子水平的研究甚少，鉴于此本研究通过检测来氟米特联合羟氯喹对RA患者治疗前后IL-17、IL-23、TGF-β的水平变化及评估各项临床试验指标的影响，检测结果显示RA患者外周血中IL-23、IL-17、TGF-β水平显著高于健康对照组，经来氟米特联合羟氯喹抗风湿治疗3个月后，其表达水平明显下降，所以我们推测来氟米特及羟氯喹可降低RA患者IL-23、IL-17、TGF-β的表达水平，为类风湿关节炎的治疗提供理论依据。

综上所述，来氟米特联合羟氯喹可改善RA患者的病情，可能通过降低RA患者IL-23、IL-17、TGF-β的表达水平，从而延缓RA疾病进展。

参 考 文 献

[1] 葛均波，徐永健.内科学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2013：808.

[2] 贺微微.Th17相关细胞因子检测在90例类风湿关节炎中的应用价值[J].检验医学与临床，2014，11（2）：229-230.

[3] Sun Y，Zhao DL，Liu ZX，et al.Correlation of nuclear factor-κB，regulatory T cell and transforming growth factor β with rheumatoid arthritis[J].Saudi J Biol Sci，2017，24（8）：1849-1852.

[4] Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum.1988，31（3）： 315-324.

[5] Gizinski AM，Fox DA.T cell subsets and their role in the pathogenesis of rheumatic disease[J].Curr Opin Rheumatol，2014，26（2）：204-210.

[6] Morgan ME，Flierman R，Van Duivenvoorde LM，et al.Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells[J].Arthritis Rheum，2005，52（07）：2212-2221.

[7] 楊金娜，刘晓光，李 覃，等.Th17/Treg平衡在类风湿关节炎中作用的研究进展[J].中国药理学通报，2013，29（8）：1045-1048.

[8] Duan Z，Pan F，Zeng Z，et al.Interleukin-23 receptor genetic polymorphisms and ankylosing spondylitis susceptibility： a meta-analysis[J].Rheumatol Int，2012，32（5）： 1209-1214.

[9] Ogawa R，Suzuki Y，Kagawa S，et al.Distinct effects of endogenous interleukin-23 on eosinophilic airway inflammation in response to different antigens[J].Allergol Int，2015，64： S24-29.

[10] 王乃志，杨丽丽，张 宁.IL-23与类风湿关节炎的相关性研究[J].中国医科大学学报2012，42（1）：59-61.

[11] 闫慧明，丁利芳，刘 媛，等.转化生长因子-β1与结缔组织生长因子在类风湿关节炎合并肺间质病变患者血清中的表达水平及临床意义[J].中国全科医学，2012，15（10A）：3268-3270.

[12] 孟 岩，李明远，张新玉.类风湿关节炎患者血清IL-21及TGF-β的表达及临床意义[J].海南医学，2017，28（21）：3496-3498.

[13] 陆 翔，王小超，陆玉敏，等.类风湿关节炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞和白介素17 及转化生长因子β的表达研究[J].中国全科医学，2010，13（10）：3355-3357.

[14] 兰 瑛，胡 蝶，宋海宁，等.甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎有效性与安全性的系统评价[J].中国药房，2016，27（21）：2928-2933.

[15] 张 舸，杨群智，付 爽，等.羟氯喹对类风湿关节炎患者关节滑液IL-1α和IL-6表达影响的研究[J].医学研究杂志，2015，44（9）：100-102.

[16] 胡秋梅.来氟米特治疗风湿免疫性疾病的临床应用研究[J].当代医药论丛，2017，15（13）：15-16.

[17] 余春晓，李 杏，孙尔维.羟氯喹抗风湿病的辛路历程[J].中华风湿病学杂志，2018，22（1）：35-37.

[18] 苏清芳，曾 玮，吴广明.羟氯喹联合来氟米特治疗对老年类风湿关节炎患者血脂的影响[J].中华老年医学杂志，2015，34（8）：889-892.