IL—33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A多态性在广西黑衣壮儿童的分布特点

林玛丽 蔡旭龙 李秀洪 曹珊 刘运广 李东秀 陈霞静 李东明 林娜

【摘要】 目的 探討IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A两位点的多态性在广西黑衣壮儿童中的分布特点及其与不同种族人群的比较。方法 采用多重连接酶检测反应（improved multi-ligase detection reaction，imLDR）技术对251例受试者（黑衣壮儿童121人，汉族儿童130人）的IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位点多态性进行基因分型。用统计学方法分析其分布频率及组间差异。结果 rs4740840G/A存在AA、AG、GG三种基因型，分布频率分别为21.5%、46.3%、32.2%。其各基因型及等位基因频率在广西黑衣壮儿童、汉族儿童中分布差异有统计学意义（P<0.05）。广西黑衣壮儿童基因型和等位基因频率与人类基因组计划公布的欧洲人相比差异有统计学意义（P<0.01），与北京汉族人、日本人、非洲黑人相比差异无统计学意义（P>0.05）。rs16924159G/A存在AA、AG、GG三种基因型，分布频率分别为5.8%、34.7%、59.5%。其各基因型及等位基因频率在广西黑衣壮儿童、汉族儿童之间差异有统计学意义（P<0.01）。广西黑衣壮儿童基因型及等位基因分布频率与人类基因组计划公布的北京汉族、非洲黑人相比差异有统计学意义（P<0.05），与日本人、欧洲人相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论 IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A在广西黑衣壮儿童分布存在多态性，同时还存在着不同程度的种族和地区差异。

【关键词】 IL-33；基因多态性；广西；黑衣壮；儿童；种族

中图分类号：R394.5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.001

【Abstract】 Objective To explore the distribution characteristics of rs4740840G/A and rs16924159G/A polymorphisms of interleukin-33（IL-33） gene in Black-clothes Zhuang children in Guangxi and its comparison with different ethnic groups.Methods The polymorphisms of rs4740840G/A and rs16924159G/A of IL-33 gene in 251subjects（121Black-clothes Zhuang children and 130 Han children） was genotyped by improved multi-ligase detection reaction （im-LDR） technique.And distribution frequencies and differences were analyzed by statistical methods between groups.Results Three genotypes （AA，AG and GG） were found in rs4740840G/A with frequency of 21.5%，46.3% and 32.2%，respectively.The genotype and allele frequencies of rs4740840G/A showed statistically significant difference between Black-clothes Zhuang children and Han children in Guangxi（P<0.05）.The frequency of genotypes and alleles in the Black-clothes Zhuang children in Guangxi was statistically different from that of the Europeans published by Human Genome Project（P<0.01），but it was not statistically different from those of Beijing Han，Japanese and African（P>0.05）.Three genotypes（AA，AG and GG） were found in rs16924159G/A with frequency of 5.8%，34.7% and 59.5%，respectively.The genotype and allele frequencies of 16924159G/A showed statistically significant difference between Black-clothes Zhuang children and Han children in Guangxi（P<0.01）.The distribution frequency of genotypes and alleles in Black-clothes Zhuang children in Guangxi was statistically significant compared with those in Beijing Han and African published by the Human Genome Project（P<0.05），but there was no statistically significant difference between the Japanese and the Europeans（P>0.05）.Conclusion The distribution of rs4740840G/A and rs16924159G/A of IL-33 gene shows polymorphisms in Black-clothes Zhuang children in Guangxi，which exists varying degrees of racial and regional differences

【Key words】 IL-33；gene polymorphism；Guangxi；Black-clothes Zhuang；ethnic group

白细胞介素33（Interleukin-33，IL-33）是ST2的配体，属于IL-1家族中的新成员，于2005年被Schmitz等[1]发现。现已证实，IL-33/ST2信号通路与感染、哮喘、系统性硬化病、心肌梗死等疾病的发病机制相关联[2～5]。由于基因多态性在种族、民族和地域间存在差异，在不同的种族、民族和地域之间，很多疾病的发病率明显不同，虽然环境、生活习惯等因素在疾病的发生过程中起着一定的作用，但不同民族在遗传背景上的差异是导致疾病易感性不同的一个重要因素[6]。近年来，IL-33的基因多态性对疾病的影响逐渐被重视，如在强直性脊柱炎、冠心病、哮喘、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、精神分裂症等均与IL-33单核苷酸多态性有关[7～12]。我们通过查找人类基因扫描图谱所公布的IL-33基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点数据中发现，IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位点突变率高，研究这两个位点在广西黑衣壮人群中的分布频率同其他民族人群是否存在着差异，为今后研究IL-33的基因多态性与不同种族、地域间的疾病易感性的影响打下基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象共251名儿童，男142人，女109人，年龄3～15岁，其中黑衣壮121人，汉族130人。民族筛选界定条件为：三代直系亲属中均为本民族的健康体检儿童。样本均取自右江民族医学院附属医院体检中心。所有研究对象均为广西地区，相互间无血缘关系。在年龄及性别组成上，两组差异无统计学意义（P>0.05）。以上研究对象患儿家属和（或）其监护人均对本研究知情，并自愿签署知情同意书。此研究已通过本单位的伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取静脉血2 ml，加入EDTAN2抗凝。用（天根M16核酸自动抽提仪）提取DNA，DNA样本取1 μL 1% agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5～10 ng/μL，-80℃保存。

1.2.2 引物设计 通过primer3在线软件（http：//primer3.ut.ee/）设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。扩增rs4740840G/A位点和rs16924159G/A位点的引物序列（见表1）。

1.2.3 检测目的基因分型 采用imLDR多重SNP分型技术对IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位点进行基因分型。PCR反应：PCR扩增反应体系（10 μL）包含1x GC-I buffer1.5 μL，Mg2+ 1.5 μL，dNTP 0.3 μL，Taq 酶1 μL，1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物，双蒸水补至10 μL。充分混匀，放入PCR扩增仪扩增。PCR反应条件：95℃×2 min；94℃×20 s，65℃×40 s，72℃×1.5 min，共11个循环；94℃×20 s，59℃×30 s，72℃×1.5 min共24个循环；72℃×2 min，4℃ forever。PCR产物纯化：在10 μL PCR产物中加入5 U虾碱酶（SAP，Promega公司）和2 U核酸外切酶Ⅰ（Epicentre公司），37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。连接反应：反应体系10x连接缓冲液1 μL、高温连接酶 0.25 μL、5连接引物混合液（1 μM）0.4 μL，3连接引物混合液（2 μM）0.4 μL、纯化后多重PCR产物2 μL、ddH2O 6 μL混匀。连接条件：94℃ 1 min→56℃ 4 min扩增38个循环，4℃ forever。取0.5 μL稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di混匀，95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪测序，并用Gene Mapper 4.1分析其基因多态性。

1.3 统计学方法

用SPSS 24.0统计软件包分析数据。各位点基因型及等位基因频率采用直接计数法，两组间基因型及等位基因频率分布差异采用χ2检验，检验水准：α=0.05。遗传平衡分析用Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果

2.1 IL-33基因位点rs4740840G/A、rs16924159G/A的基因分型 经Hardy-Weinberg平衡检验分析，两位点基因型均达Hardy-Weinberg平衡，所选人群群体代表性好（均P>0.05），结果具有群体代表性。rs4740840G/A存在三种基因型，分别为AA、AG、GG，基因型峰型见图1。rs16924159G/A存在三种基因型，分别为AA、AG、GG，基因型峰型见图2。

2.2 两位点在广西黑衣壮儿童、汉族儿童之间的分布及与各种族人群间比较 IL-33基因rs4740840G/A存在3个基因型：AA、AG、GG，其基因型及等位基因的分布频率在广西地区黑衣壮儿童、汉族儿童之间的分布差异有统计学意义（P<0.05）。广西黑衣壮儿童各基因型及等位基因的分布频率与欧洲人相比差异有统计学意义（P<0.01），与北京汉族人、日本人、非洲黑人相比差异无统计学意义（P>0.05）。广西汉族儿童与北京汉族人群在基因型频率分布上差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。rs16924159G/A存在3个基因型：AA、AG、GG。广西黑衣壮儿童基因型及等位基因的分布频率与广西汉族儿童、北京汉族、非洲黑人相比差异均有统计学意义（P<0.05），与日本人及欧洲人相比差异无统计学意义（P>0.05）。广西汉族儿童与北京汉族人群在基因型及等位基因频率分布上均无统计学意义（P>0.05）。見表3。

3 討论

近年来，随着分子生物学及基因组学的发展，人们发现IL-33基因序列中存在多个SNP位点，而这些多态性位点可能与某些疾病的发病机制存在一定关系。遗传和地域差异可以导致某些疾病易感性不同，通过对不同地域人群基因多态性的研究，一方面，有助于进一步了解某一疾病的易感性在不同种族人群间的表达，对某些疾病的基因诊断及治疗有更深远的意义，为将来在不同种族人群中进行个体化治疗提供更完善的方案；另一方面，有助于进一步丰富我国少数民族基因多态性的数据库。通过对正常人群基因多态性的研究，为今后研究疾病与基因多态性的关系提供了更有利的条件。

人类IL-33基因定位于9号染色体（9p24.1）上，编码270个氨基酸多肽，其相对分子质量为30 kDa[9]。IL-33作为IL-1家族的第11位细胞因子，其结构与IL-1α、IL-18β-三叶结构域相似，主要在上皮细胞及内皮细胞中表达，如呼吸道、消化道、皮肤等黏膜组织，在脾脏、胰腺、肾脏、心脏等组织中也有少量表达[13]。IL-33是一种多功能因子，它既可以作为一种核因子调控基因的转录，又可以作为细胞因子参与调节Th2型的免疫反应[14～15]。关于IL-33基因SNP的研究，Queiroz GA等[16]在巴西人口的研究中发现，IL-33和IL1RL1单核苷酸多态性与过敏和哮喘的遗传变异标记具有一定关联性。Yue J等[14]发现IL-33 rs16924159可能与中国汉族人群复发性流产的发病机制有关。Angeles-Martínez J等[17]发现IL-33 rs7044343 T等位基因与降低墨西哥患者早发冠心病和中心性肥胖的风险有关，并可能参与调节细胞的生产，而rs16924159与冠心病及中心性肥胖的发生无明显相关性。这可能与IL-33基因存在多个功能性SNP位点有关，从而影响某些疾病的发生、发展[18]。

壮族是中国人口最多的一个少数民族，主要分布在广西，地处中国西南边界，其地貌独特，人群及生活环境相对稳定，而黑衣壮是壮族的一个支系，主要聚居在广西那坡县境内[19～ 20]。本文检测了广西黑衣壮、汉族两族健康儿童人群IL-33 rs4740840G/A、rs16924159G/A多态性位点分布，分析比较该多态性位点与不同种族、地域间的分布差异，研究对象年龄及性别组成上无明显差异。我们的研究发现，IL-33 rs4740840G/A、rs16924159G/A两位点在广西黑衣壮儿童、汉族儿童之间均存在明显差异，说明这两个位点在同一地域及生活环境下同样也存在着较强的种族性差异，rs4740840G/A在广西黑衣壮儿童与北京汉族人群之间并无显著差异，而rs16924159G/A在广西黑衣壮儿童与北京汉族人群之间却存在显著差异，这又体现了同一基因的不同位点在中国南北人群间的差异，这可能与广西特殊的地理位置及黑衣壮独有的民族特色有关，因此遗传背景相对单纯。rs4740840G/A在广西汉族儿童与北京汉族人群之间存在差异，这又说明同一种族，环境地域不同可能对基因突变有影响。因地域跨度较大，可能存在一定的遗传素质差异。此外，我国人口众多，且为多民族、多元化国家，遗传背景复杂。而广西黑衣壮儿童与欧洲人及非洲黑人为不同肤色不同种族人群，亲缘关系较远，多态性分布差异大，本次研究验证了多态性位点rs4740840G/A、rs16924159G/A分别在欧洲人及非洲黑人上体现出了这一明显差异，无论是基因型还是等位基因频率。同一基因不同多态性位点与同一种族的关系研究结果不同，除了与地域差异有关，还可能是由于某一基因片段在不同种族人群间的表达不同造成的。而多态性的分布差异除了与种族、地域相关外，不同的生活环境、饮食、生活方式、气候等因素亦会影响基因多态性的分布差异。本研究主要针对广西地区的黑衣壮儿童进行遗传多态性与不同地区民族及不同种族进行比较，因为不同地域人群遗传性存在差异，可能造成了研究结果的不一致。

SNP作为人群、地域的一种标志，是可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的 90%以上，与种族差异、疾病易感性及药物反应差异有关。近年来，随着基因测序等技术的不断发展，人们发现不同的遗传背景表现出对疾病的易感性和预后质量呈现出不同差异，因此正确分析各基因多态性的分布特点，一方面，为研究IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位点多态性与相关疾病的发病机制以及疾病的防治提供科学有效的途径，另一方面，也为人类学和群体遗传学的研究提供基础理论知识。同时，我们的研究也存在不足，一是由于本实验样本量较少，并受到实验和环境等因素影响，这种分布差异仍需大量实验证实，其次是未与更多人群进行分析比较，结果仅具有区域代表性，如何深入研究 IL-33基因多态性在不同民族、种族人群中对疾病的影响，是今后我们努力研究的方向。

参 考 文 献

[1] Schmitz J，Owyang A，Oldham E，et al.IL-33，an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines[J].Immunity，2005，23（5）：479-490.

[2] Rostan O，Arshad MI，Piquet-Pellorce C，et al.Crucial and diverse role of the interleukin-33/ST2 axis in infectious diseases[J].Infect Immun，2015，83（5）：1738-1748.

[3] 蔡旭龙，林 娜.白介素-9基因多态性及其血清水平与黑衣壮儿童哮喘发病的关系[J].广西医学，2017，39（1）：15-17.

[4] Koca SS，Pehlivan Y，Kara M，et al.The IL-33 gene is related to increased susceptibility to systemic sclerosis[J].Rheumatol Int，2016，36（4）：579-584.

[5] Yang JH，Wu FQ，Wen Q，et al.Association of IL33/ST2 signal pathway gene polymorphisms with myocardial infarction in a Chinese Han population[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2015，35（1）：16-20.

[6] Guo J，Xiang Y，Peng YF，et al.The association of novel IL-33 polymorphisms with sIL-33 and risk of systemic lupus erythematosus[J].Mol Immunol，2016，77：1-7.

[7] Fan D，Ding N，Yang T，et al.Single nucleotide polymorphisms of the interleukin-33 （IL-33） gene are associated with ankylosing spondylitis in Chinese individuals： a case-control pilot study[J].Scand J Rheumatol，2014，43（5）：374-379.

[8] Tu X，Nie S，Liao Y，et al.The IL-33-ST2L pathway is associated with coronary artery disease in a Chinese Han population[J].Am J Hum Genet，2013，93（4）：652-660.

[9] Charrad R，Kaabachi W，Berraies A，et al.IL-33 gene variants and protein expression in pediatric Tunisian asthmatic patients[J].Cytokine，2018，104：85-91.

[10] Zhong X，Liu MY，He M，et al.Association of interleukin-33 gene polymorphisms with susceptibility to late onset Alzheimer's disease：a meta-analysis[J].Neuropsychiatr Dis Treat，2017，13：2275-2284.

[11] Xu W，Liu Y，Ye D.Association between IL-33 Gene Polymorphisms （rs1929992，rs7044343） and Systemic Lupus Erythematosus in a Chinese Han Population[J].Immunol Invest，2016，45（7）：575-583.

[12] Kordi-Tamandani DM，Bahrami AR，Sabbaghi-Ghale-No R，et al.Analysis of IL-33 gene polymorphism （rs11792633 C/T） and risk of schizophrenia[J].Mol Biol Res Commun，2016，5（1）：45-48.

[13] Sun XL，Law BY，de Seabra RDI，et al.Pathogenesis of thromboangiitis obliterans：Gene polymorphism and immunoregulation of human vascular endothelial cells[J].Atherosclerosis，2017，265：258-265.

[14] Yue J，Tong Y，Xie L，et al.Genetic variant in IL-33 is associated with idiopathic recurrent miscarriage in Chinese Han population[J].Sci Rep，2016，6：23806.

[15] Ren X，Guo M，Liu C，et al.A Case-Control Study Indicates that no Association Exists Between Polymorphisms of IL-33 and IL-1RL1 and Preeclampsia[J].Cell Physiol Biochem，2016，38（4）：1406-1414.

[16] Queiroz GA，Costa RS，Alcantara-Neves NM，et al.IL33 and IL1RL1 variants are associated with asthma and atopy in a Brazilian population[J].Int J Immunogenet，2017，44（2）：51-61.

[17] Angeles-Martínez J，Posadas-Sanchez R，Llorente L，et al.The rs7044343 Polymorphism of the Interleukin 33 Gene Is Associated with Decreased Risk of Developing Premature Coronary Artery Disease and Central Obesity，and Could Be Involved in Regulating the Production of IL-33[J].PLoS One，2017，12（1）：e168828.

[18] 郭 靜，向 阳，黄华佗，等.广西人群中白介素-33基因rsl891385A/C、rs10975519C/T多态性的分布特点[J].南方医科大学学报，2016，36（7）：964-968.

[19] 郭 静，向 阳，彭友帆，等.广西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G多态性的分布特点[J].中国免疫学杂志，2016，32（6）：849-852.

[20] 吴晓静，钟丹妮，叶德志，等.广西黑衣壮族高胆红素血症新生儿UGT1A1 基因突变分析[J].中国当代儿科杂志，2014，16（5）：483-488.