核受体FXR基因多态性与肺炎脓毒症临床转归的相关性研究

法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor,FXR)属于核受体超家族成员之一,本质是配体激活的转录因子,在细胞核内通过调控靶基因的转录而发挥重要的生理功能。研究表明,除了在胆汁酸、糖、脂代谢中具有作用外,FXR还对炎症反应具有重要的调节作用[1]。FXR活化后与炎症因子基因启动子区中DNA特异位点结合,通过调控炎症因子的转录和表达而发挥抗炎作用[2]。本文以FXR基因为候选基因,在中国华东汉族人群中分析FXR基因常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与肺炎脓毒症临床转归的相关性,为临床脓毒症高危病人早期诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 自2014年2月至2015年2月,参照2001年美国胸科医师学会和危重病医学会制定的脓毒症诊断和分级标准,连续收集南京军区南京总医院呼吸科收治的由肺部感染导致的脓毒症病人194例。入选标准:(1)年龄≥16周岁;(2)汉族,籍贯为江苏及其周边地区(浙江、安徽、上海),相互间无生物学亲缘关系;(3)脓毒症诊断明确且原发感染灶为肺部;(4)病史资料和临床实验室检查和辅助检查结果完整。排除标准:(1)入院后24 h内死亡;(2)具有其他特殊疾病,如获得性免疫缺陷综合征、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植后;心、肝、肾、肺、脑等重要器官功能衰竭终末期;(3)曾摄入或应用过对炎症过程有调节作用的细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα, TNF-α)抗体、干扰素-γ等;(4)接受免疫抑制剂和激素治疗;(5)孕妇。采用调查表的形式收集病人的社会人口学资料(年龄、性别、民族、籍贯、身高、体质量)、既往病史、吸烟史、饮酒史、实验室检查和辅助检查结果、感染部位及脓毒症诊断基本指标(体温、心率、呼吸频率、血压、白细胞计数、微生物培养结果)、诊断脓毒症后24 h内急性生理与慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluation, APACHE Ⅱ)等，采用Marshall MODS评分系统[3]计算住院期间最高多器官功能障碍评分(multiple organ dysfunction score, MODS)、临床转归。采用氧合指数、血小板计数、血清胆红素水平、血压校正的心率和格拉斯哥昏迷评分对病人呼吸、血液、肝脏、心血管、中枢神经、肾脏功能进行评分,所得总分即为MODS评分。所有入选病人抽取静脉血3 mL,枸橼酸钠抗凝,-80 ℃保存备用。所有受试者均签署知情同意书。本研究经南京军区南京总医院伦理委员会审核通过(批准号:2014NZGKJ-024)。

1.2 诊断标准 脓毒症:临床上有感染证据或高度可疑感染,合并体温>38.5 ℃或<36 ℃和白细胞总数>12×109或<4×109。脓毒性休克:脓毒症病人经液体复苏治疗1 h后动脉收缩压仍<90 mmHg或需要血管活性药物治疗才能维持收缩压>90 mmHg。多器官功能障碍:住院期间连续2 d或有3 d MODS评分>12分。根据最高MODS评分将脓毒症病人分为轻度器官功能障碍(MODS评分0～8分)组和重度器官功能障碍组(MODS评分9～18分)。

1.3 SNP位点的选择 在PubMed上查阅文献,找到已发表的FXR基因上与疾病相关的SNPs位点;同时查阅NCBI的dbSNP数据库,找到位于FXR基因功能区(外显子、3′及5′非翻译区)的SNPs位点;最后从HapMap数据库中选择北京汉族人群样本,以r2>0.8,作为条件,得到标签SNPs(Tag SNPs)。以上得到的SNPs位点且在中国人群中次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)大于10%为入选,最终得到11个SNPs,见表1。

1.4 基因分型 采用德国QIAGEN试剂盒提取外周静脉血DNA。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的多重连接酶检测反应(iMLDR)分型方法。根据dbSNP数据库提供的基因组序列自行设计引物。PCR过程中设置阴性对照。实验结束后随机双盲挑取20个标本进行重复性检验,重复率达100%。

表1 FXR基因SNPs位点信息

1.5 统计学分析 使用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料组间比较采用独立样本的t检验,计数资料组间比较采用χ2检验。计数每个SNPs位点的基因型频率,进行goodness-of-fit χ2检验,判断是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用非条件Logistic回归模型校正年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、基础疾病和诊断脓毒症24 h后APACHE Ⅱ评分,在不同的遗传模式下分析各位点基因型频率与脓毒症临床转归的相关性。所有统计均为双侧检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共收集脓毒症病人194例,年龄16～95岁,平均(61.90±18.47)岁,男124例,女70例,60岁以下75例(38.66%)。病原微生物中最常见的革兰阴性致病菌为铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌;最常见的革兰阳性球菌为金黄色葡萄球菌。单纯真菌感染12例(6.19%),其中曲霉菌感染4例。30.93%的病人未培养出致病微生物。住院期间发生脓毒性休克51例(26.29%)、重度器官功能障碍41例(21.13%)、死亡57例(29.38%)。各组之间的社会人口学资料和临床特征比较见表2。

表2 不同组间社会人口学和临床特征比较

注:同组内比较,*P<0.05，**P<0.001

2.2 FXR基因多态性与脓毒症临床转归的相关性 所有位点的频率分布在脓毒症组中均符合Hardy-Weinberg平衡。校正年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、基础疾病后,非条件Logistic 回归分析显示,rs17030270 GG基因型发生重度器官功能障碍的风险较AA/AA+GA型增高[OR(95%CI)=7.13(1.83～27.77)和6.98(2.04～23.90)];rs11110411 CC基因型较TT/TT+CT发生重度器官功能障碍的风险增高[OR(95%CI)=4.72(1.24～18.00)和4.13(1.50～11.32)];rs35735TT基因型较GG/GG+GT基因型发生重度器官功能障碍的风险增高[OR(95%CI)=6.52(1.58～26.98)和6.50(1.69～25.02)];rs1030454GG基因型较AA/AA+GA基因型发生重度器官功能障碍的风险降低[OR(95%CI)=0.05(0.01～0.52),和0.09(0.01～0.80)];GA+GG基因型较AA基因型发生重度器官功能障碍的风险降低[OR(95%CI)=0.29(0.12～0.72)],见表3。FXR基因多态性与脓毒性休克和死亡均无关。

表3 FXR基因多态性与脓毒症临床转归的相关性

3 讨论

越来越多的研究表明,FXR具有抗炎作用。FXR敲除小鼠脾巨噬细胞产生细胞因子和趋化因子增多,对炎症刺激的敏感性增强;鼠结肠炎模型中,FXR缺陷小鼠较野生型更易于发生结肠损害,FXR配体能够有效地抑制野生型小鼠结肠炎症反应[4];FXR基因敲除小鼠易于发生内毒素性休克,而FXR基因高表达小鼠更能抵抗内毒素性休克。除了通过调节靶基因转录和表达而发挥抗炎作用外,FXR还可通过其他机制调节炎症反应。胆汁淤积是脓毒症的常见并发症且与脓毒症预后相关。血浆中的胆汁酸,尤其是鹅去氧胆酸和去氧胆酸能作为危险相关分子模式(dangerassociatedmolecularpattern,DAMP),可激活炎症状态下巨噬细胞中的NLRP3炎性小体,增进促炎因子白介素(IL)-1β和IL-18的成熟与释放,从而加重炎症反应，导致不良预后。预先给予胆汁酸螯合剂——消胆胺能显著降低脓毒症小鼠血浆中胆汁酸和IL-1β的水平,提高生存率。FXR通过调节胆汁酸合成与转运过程中相关靶基因的转录来维持体内胆汁酸水平的稳态。FXR基因敲除鼠血浆胆汁酸水平和IL-1β明显增高,更易于发生脂多糖诱导的死亡。体外研究中利用腺病毒转染提高FXR表达能恢复血浆胆汁酸水平,降低IL-1β浓度,抑制半胱天冬酶-1(caspase-1)的活性。FXR还能通过直接与NLRP3炎性小体中的NLRP3和caspase-1结合而抑制NLRP3炎性小体的功能,减少促炎因子IL-1β和IL-18的产生而发挥抗炎作用[5]。

本研究以FXR基因为脓毒症的候选基因,在194例肺炎脓毒症病人中发现FXR基因中有4个SNPs位点与器官功能障碍严重程度相关:rs17030270、rs11110411、rs35735与重度器官功能障碍风险增高有关,rs1030454 则与重度器官功能障碍风险降低有关。没有发现SNP位点与脓毒性休克或死亡相关。既往关于FXR基因多态性与疾病相关性研究主要集中在胆石症、糖脂代谢紊乱、肿瘤等[6-8],而与炎症或感染性疾病的相关性研究较少。目前未见有FXR基因多态性与脓毒症的相关性研究报道。Attinkara等[9]在欧洲人中的研究发现,FXR基因rs56163822T等位基因能够增加炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)的风险,但在不同人群中,结论不一致,Nijmeijer等[10]对荷兰人的研究中没有发现此种相关性。

本研究发现FXR基因中有4个SNPs位点(rs17030270、rs11110411、rs35735、rs1030454)与肺炎脓毒症临床转归相关,这4个位点均位于内含子中,且既往研究报道较少,其与疾病的关系和功能还不清楚。内含子区突变可能通过影响mRNA的剪切、稳定性或定位来影响基因的功能[11],也可能是这些阳性位点因和其他与脓毒症有关的SNPs位点连锁,而表现出与脓毒症相关,具体机制还需要进一步研究。

本研究发现FXR基因多态性与脓毒症器官功能障碍相关。但样本量较少,统计效力不够,导致一些低外显率的SNPs位点的效应发现不了,也不排除阳性位点因和其他与脓毒症有关的SNPs位点连锁,而表现出与脓毒症临床转归相关。因此还需要扩大样本量对研究结果进一步验证。