大黄、黄芩、诃子、黄连对嗜水气单胞菌体外抑菌效果的Meta分析

2018-08-04黄艳华张在屋牛志伟黎姗梅梁静真吕小丽韦慕兰程光平

西南农业学报 2018年6期

黄艳华，张在屋，牛志伟，黎姗梅，梁静真，吕小丽，韦慕兰，黄维，程光平，黄钧*

(1. 广西水生动物病害诊断实验室/广西大学动物科学技术学院/广西高校水生生物健康养殖与营养调控重点实验室，广西南宁 530005；2. 钦州市水产技术推广站，广西钦州 535000；3.上海新球环境工程咨询有限公司，上海 201311； 4. 广西水产技术推广总站，广西南宁 530022；5. 陆川县水产养殖技术推广站，广西陆川 537700；6. 都安瑶族自治县水产技术推广站，广西都安 530700；7. 田东县水产技术推广站，广西田东 531500)

【研究意义】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)隶属于弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，分布广泛，毒性强[1]，可引起四大家鱼、团头鲂(Megalobramaamblycephala)、斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)、罗非鱼(Oreochromisspp.)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、黄沙鳖(TrionyxSinensis)、山瑞鳖(Paleasteindachneri)等多种水生养殖动物感染发病，死亡率高[2]，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。在生产过程中，养殖户多采用抗生素或疫苗接种对嗜水气单胞菌引起的疾病进行防治，但因诊治和科学水平所限，养殖户往往仅凭经验用药，难免存在盲目使用抗生素的情况，不仅导致不少病原菌产生了耐药性[3]，还容易引起环境污染和药物残留等问题[4]。疫苗接种虽是控制养殖动物细菌性疾病的有效途径，但是灭活疫苗、弱毒活疫苗受血清型多样性的限制，不能有效防治多种类型病原菌引起的疾病[5]；注射法接种疫苗容易引起鱼体损伤[6]；浸泡法接种疫苗其浸泡时间和菌液浓度不易控制，多次浸泡容易造成浸浴液发生恶化或者造成缺氧[7]；口服法接种疫苗容易被养殖对象体内的酶降解或不能被吸收[8]。因此，探索安全高效、操作简单、损伤小、价格低廉的药物防治嗜水气单胞菌病，对减少该病造成的环境污染和经济损失具有重要意义[9]。中草药具有来源天然、不易产生耐药性、副作用小、对环境污染小、价格低廉等特点[10-11]，已被广泛应用于水产动物的病害防治。【前人研究进展】关于用中草药对嗜水气单胞菌的抑菌效果研究，张海宾和杨桂芳等[12]的结果表明五倍子(Rhuschinensis)、大黄、乌梅(Prunusmume)、黄连的抑菌作用优于地榆(Sanguisorbaofficinalis)、黄柏(Platycladusorientalis)、野菊(Chrysanthemumindicum)。肖辉等[13]检测了16 种中草药提取物对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果，结果表明诃子、大黄、黄连的抑菌效果最好。姜巨峰等[14]发现诃子等3种中草药对嗜水气单胞菌有比较强的抑菌作用。赵蓓蓓等[15]也发现黄芩等4种中草药抑菌效果优于其他等6种中草药。而地榆、夏枯草(Prunellavulgaris)、丁香(Syringaoblata)的抑菌效果优于黄连、黄芩、大黄和乌梅[16]；李秋云等[17]的结果表明抑菌作用强弱顺序为五倍子、虎杖(Reynoutriajaponica)、黄芩、大黄、石榴(Punicagranatum)皮。由此可见，各种中草药对嗜水气单胞菌体外抑菌效果不尽相同，同种中草药对嗜水气单胞菌的抑菌作用大小并不完全一致，因此难以根据这些研究结果准确地指导养殖户科学用药。【本研究切入点】Meta分析是一种可以扩大试验样本量，对许多相同研究进行合并汇总的分析方法。当多个研究结果不一致时，能科学地分析出最贴近真实情况的结果，目前该分析方法已广泛应用于畜牧学、医学[18]等领域，而应用于水产养殖病害防控的研究仍不多见。【拟解决的关键问题】本研究采用Meta分析法对CNKI数据库中关于大黄、黄连、诃子、黄芩4种中草药体外抑制嗜水气单胞菌效果的研究进行合并分析，以期为防治水生动物嗜水气单胞菌病的中草药研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 检索文献

参考牛志伟等[9]的方法，在中国知网(CNKI)数据库，检索时限为建库至2018年1月，以嗜水气单胞菌、中药、中草药、大黄、诃子、黄芩、黄连、抑菌、抑制等作为检索词，在CNKI数据库进行检索，并追溯纳入文献的参考文献。具体检索策略为：#1嗜水气单胞菌；#2 抑制OR抑菌OR抑杀OR筛选；#3 中药OR中草药OR大黄OR诃子OR黄连OR黄芩； #4 #1 AND #2 AND #3。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①研究对象是单味中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果；②数据统计结果是用平均数和标准差或平均数和标准误表示。排除标准：①重复发表或数据相同的研究；②药敏结果为直接读数或仅用平均数表示的研究；③排除数据不详或商业评价性质的文献。

1.3 文献筛选和资料提取

由2名人员根据上述的纳入和排除标准，分别筛选和提取数据，在筛选提取数据时遇到分歧，则用讨论法解决。提取的主要数据：第一作者，题目，药物提取方法，最终菌液浓度(0.5麦氏比浊单位=1.5×108CFU/mL)，药液浓度，抑菌圈直径，重复次数(不详则按1次计算)等数据。

1.4 统计与分析

使用软件Reviewer manager(RevMan)5.3进行Meta分析。采用I2对所得结果进行异质性检验，当I2≥50 %时表示研究结果之间有明显异质性，使用随机效应模型进行分析。当I2<50 %时表示研究结果之间没有明显异质性，使用固定效应模型进行分析；以P<0.05作为有统计学意义的标准。

2 结果与分析

2.1 纳入文献结果

共检索到89篇文献，排除重复发表文献1篇，阅读全文排除综述、重复发表等不符合纳入标准的文献23篇，文献筛选流程见图1。最终纳入8篇文献14个研究，发表时间为2007-2014年(表1～2)。

图1 文献筛选流程与结果Fig.1 Process and results of screening of studies

第一作者First author文献信息Article information卢春霞复方植物提取物对嗜水气单胞菌抑菌作用的研究[D].无锡:江南大学,2011: 21-48.吴清洋汕头牛田洋锯缘青蟹病害发生的环境因素及中草药防治研究[D]. 汕头:汕头大学, 2009: 6-39.周飞黄鳝嗜水气单胞菌的分离鉴定及中草药体外抑菌效果研究[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37(2): 135-137. 李茜23种中草药及复方对鲫肠道3种细菌的体外抑菌试验[J]. 淡水渔业, 2007, 37(4): 7-11. 何爱华6种中草药对4种淡水鱼致病菌体外抑菌作用的研究[J]. 南方水产科学, 2011, 7(2): 73-76.苏振霞中草药单味药及复方对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用[J]. 中国兽医杂志, 2011, 47(11): 52-54.姚嘉赟29种中草药提取物对嗜水气单胞菌的抑菌活性研究[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(26): 12911-12912.马玉和5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌抑菌效果的比较[J]. 饲料工业, 2014, 35(16): 51-54.

注：*K-B法指纸片法。

Note：*K-B method denotes the disc method.

图2 大黄与黄芩对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析Fig.2 Meta analysis on the antibacterial effects of Rheum officinale and Scutellaria baicalensis on Aeromonas hydrophila

2.2 中草药体外抑菌效果的Meta分析

2.2.1 大黄和黄芩对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析纳入4篇文献[18]10个研究，异质性分析结果为(P<0.00001，I2=92 %)，采用随机效应模型分析，结果表明大黄的抑菌效果大于黄芩[MD=0.85，95 %CI(0.02，1.68)，P=0.04]，且有统计学意义(图2)。

2.2.2 黄连和大黄对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析纳入5篇文献11个研究(图3)，异质性分析结果为(P<0.00001，I2=99 %)，采用随机效应模型分析，结果表明黄连的抑菌效果小于大黄[MD=-3.41，95 %CI(-5.61，-1.21)，P=0.002]，且有统计学意义。

2.2.3 黄连和黄芩对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析纳入3篇文献共9个研究(图4)，异质性分析结果为(P<0.0001，I2=98 %)，采用随机效应模型分析，结果表明黄连的抑菌效果显著低于黄芩 [MD=-4.60，95 %CI(-6.03，-3.17)，P<0.0001]。

2.2.4 黄芩和诃子对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析纳入3篇文献9个研究(图5)，异质性分析结果为(P<0.00001，I2=94 %)，采用随机效应模型分析，结果表明黄芩组与诃子组的抑菌效果差异不显著 [MD=-0.33，95 %CI(-1.54，0.88)，P=0.59]。

图3 黄连与大黄对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析Fig.3 Meta analysis on the antibacterial effects of Coptis chinensis and Rheum officinale on Aeromonas hydrophila

图4 黄连和黄芩对嗜水气单胞菌抑制作用的Meta分析Fig.4 Meta analysis on the antibacterial effects of Coptis chinensis and Scutellaria baicalensis on Aeromonas hydrophila

2.3 敏感性分析

将上述随机效应模型统一换成固定效应模型进行敏感性分析，大黄和黄芩组、黄连和大黄组、黄连和黄芩组、黄芩和诃子组得到的结果和随机效应模型分析结果一致，说明本次Meta分析的结果稳定(表3)。

2.4 异质性分析

去除中草药来源、中草药提取方法、药液浓度、药敏方法、菌液浓度不同的文献后，仅留下卢春霞的7个研究，进行异质性分析结果，大黄VS黄芩组为(P<0.0001，I2=79 %)、黄连VS大黄组为(P<0.00001，I2=82 %)、黄连VS黄芩组为(P<0.00001，I2=90 %)、黄芩VS诃子组为(P<0.00001，I2=90 %)，异质性均比之前所有下降，但数值仍比较大(I2>50 %)，表明大黄VS黄芩组、黄连VS大黄组、黄连VS黄芩组、黄芩VS诃子组的异质性主要由菌株来源不同引起。

3 讨论

嗜水气单胞菌广泛存在于自然界，是造成我国水产养殖经济损失的主要致病菌之一[1-2]。目前在生产上主要依赖抗生素对嗜水气单胞菌引起的疾病进行治疗，容易带来细菌耐药性等问题[3]。而中草药具有成分天然、副作用小、环保、价格低廉、不容易产生耐药性等优点，目前已成为渔药研究的热点。其中，大黄、黄芩、诃子、黄连是常见的中草药。大黄具有抗菌、退热、止血等作用，可以与DNA结合来抑制细菌DNA和蛋白质的合成[19]，有效成分大黄素还能通过抑制线粒体NADH氧化酶和琥珀酸氧化酶来抑制细菌的呼吸作用等从而抑制细菌生长[20]。黄芩主要有效成分是黄酮及其苷类，具有护肝、抗菌、解热等功效，可以抑制细菌ATP合成酶、微生物被膜的形成及抑制某些细菌蛋白的表达[21]。诃子主要成分为鞣质，对肝细胞膜起保护作用，可以收敛和沉淀细菌蛋白，使细菌死亡[22]。黄连主要有效成分为小檗碱等多种异喹啉类生物碱，有止泻、抗炎、抗溃疡等作用[23]，对革兰氏阳性和阴性菌以及真菌类均有一定的抑制作用[24]，其杀菌机制可能是小檗碱通过抑制细菌葡萄糖及糖代谢中间产物的氧化过程从而杀灭细菌[25]。已有学者针对中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌试验结果表明，大黄、黄芩、诃子、黄连对嗜水气单胞菌均具有较好的抑菌效果[12-13,15]。因此，中草药在一定程度上具有取代抗生素用于水产动物细菌性疾病防治的潜力。

Meta分析是对多个相同研究的结果进行合并汇总的分析方法，可以从统计学角度达到增大样本量，从而提髙检验效能的目的，尤其当多个研究结果不一致时，采用分析可得到更加接近真实情况的综合分析结果[18]。本研究利用Meta分析法合并不同来源的嗜水气单胞菌菌株对大黄、黄连、诃子、黄芩4种中草药敏感程度进行分析评价，结果显示4种中草药对不同来源嗜水气单胞菌的体外抑菌效果最佳为大黄，其次为黄芩和诃子，最弱为黄连，该结果具有统计学意义；更换分析模型的敏感性分析结果与Meta分析结果一致，说明本研究分析结果稳定。经过异质性检验，我们发现纳入Meta分析的研究之间存在显著的异质性(I2>50 %)。不同文献的中草药来源及提取方法、药敏实验方法、药液和菌液配置浓度存在较大差异，为研究异质性的来源去掉材料和研究方法不同的文献后，发现异质性主要由不同菌株对中草药敏感程度不同造成，提示不同来源菌株对中草药的敏感程度不同，是造成药敏结果差异的主要原因，与对五倍子等4种中草药对嗜水气单胞菌抑菌效果的异质性分析结果[9]相似。因此，本研究所选取的试验，其药敏结果只能针对被选取的菌株，结果代表性不够全面，广泛应用难度较大，从而影响了科研成果的大范围有效推广[9]。建议做中草药抑菌效果试验时，应以某一个养殖区域为基础，增加待试菌株的样本量，统一中草药的提取和试验方法，以减少组间异质性，提高分析结果的代表性和可应用推广价值。