天山雪莲sikP基因提高番茄类黄酮含量的研究

张 尧，李忠晴，张 丽，王爱英，祝建波

(石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆 石河子 832003)

【研究意义】对植物类黄酮分子调控深入研究发现，类黄酮可增强植物的抗逆性、改变花卉的颜色等多方面的作用[1]。通过将单个限制酶基因转入薄荷、大豆和油菜中，对其次生代谢进行调控，可提高他们的目标产物的含量[2-3]。然而，复杂的植物次生代谢途径需要大量酶的参与，而不是单个基因所能决定的。【前人研究进展】近年来人们对转录因子深入研究发现，在转录水平上，转录因子能够协同调控特定代谢途径的一系列相关酶的活性，从而提高途径中相关基因的表达量，因此转录因子在多数性状调控途径中具备很大优势[4]。相关研究表明，MYB家族基因是高等植物中广泛存在的转录因子，具备许多转录因子的结构特征，根据含MYB-DNA结合结构域(R1、R2、R3)数量的不同，分为R1、R2R3、R1R2R3 3种类型，其中R2R3类型在调控植物次生代谢过程中起到十分重要的作用。其中玉米P基因是在植物中最早被发现且功能被验证的R2R3型MYB转录因子，它通过调控CHS和DFR基因的表达来促进玉米3-脱氧类黄酮的合成[5]。金治平等人从水母雪莲愈伤组织中克隆了水母雪莲MYB转录因子SmP,对氨基酸进行同源分析发现SmP基因具有转录因子结构域典型的特征，存在2个R2R3型MYB结构域[6]。但该基因是否能够调控类黄酮合成，并没有进行进一步深入的研究。新疆地域辽阔，物种资源丰富，其中不乏特色的中药材，天山雪莲就是其中一种[7]。天山雪莲中存在多种药用成分，比如类黄酮、多糖类物质和生物碱等[8-9]，其中类黄酮是新疆天山雪莲最主要的药用成分[10]。据研究表明天山雪莲总黄酮的抗氧化活性高于水母雪莲和雪兔子[11]。【本研究切入点】本文将天山雪莲R2R3-MYB转录因子sikP基因的表达载体，通过农杆菌介导遗传转化番茄，并通过分子手段进行鉴定获得转基因番茄。【拟解决的关键问题】对其类黄酮含量进行初步检测，已达到对其功能进行验证的目的。

1 材料与方法

1.1 供试材料

番茄(亚心87-5)保存于新疆石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室。农杆菌(GV3101)、植物过表达载体pBI121-sikP来自于新疆石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室Taq酶、RNA反转录酶、Trizol提取液、植物激素和抗生素等均来自大连宝生物生物工程有限公司；配制MS培养基的各种试剂盒其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 农杆菌介导叶盘转化法转化番茄 首先在无菌超净工作台中将番茄种子放入10 %次氯酸钠中浸泡10 min，期间不间断的摇晃，再用无菌水进行5次冲洗，再将番茄种子倾倒无菌滤纸上进行水分吸干，均匀接种到1/2MS培养基上，用封口膜密封后进行3 d黑暗条件培养，待番茄种子露白后进行正常的光照培养，1周后，切取番茄下胚轴作为外植体放置在培养基(MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IAA)上暗培养2 d后，将携带有PBI121-sikP载体的农杆菌侵染预培养2 d的番茄下胚轴[10-11]，侵染时间为10～15 min。将侵染过的下胚轴转移到筛选培养基( MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Cef)上培养，每14 d换1次培养基。定期进行观察待分化出的小芽长至2～3 cm后，将其切下并转入生根培养基(1/2 MS+0.5 mg/L IAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Cef)中继续进行抗性筛选，最终获得抗性苗。

1.2.2 转基因番茄的PCR和RT-PCR鉴定 首先提取抗性番茄苗DNA，并以未转化的番茄作为对照进行PCR扩增[12]。然后提取PCR阳性的番茄植株的RNA[13]，同样以未转化的番茄作为对照在逆转录酶的作用下进行cDNA 的合成，再进行PCR的扩增。将通过筛选和鉴定的阳性番茄植株移栽至深18 cm、直径20 cm的花盆中，在培养室正常条件下生长。

1.2.3 转基因番茄总黄酮含量的测定[14]①样品溶液的制备。待测样品采用超声波法进行样品溶液的制备，精确称取3 g番茄叶片，将其放入锥形瓶中，加入55 mL 95 %的乙醇，将其放入水温为50 ℃的超声波清洗器进行20 min处理后，将其转移到旋转蒸发器内进行浓缩处理至5 mL即为番茄样品溶液。②对照品溶液的制备。精确称取20 mg对照品芦丁放入100 mL的容量瓶内，加入70 %的乙醇进行溶解后定容至0.2 g/L，作为标准品溶液。③最大吸收波长的确定。取适量的样品溶液，加入5 %亚硝酸钠溶液，通过硝酸铝进行显色，再进行420～700 nm波长扫描，最终进行最大吸收波长的确定。④标准曲线的制备。取对照品芦丁储备溶液通过70 %的乙醇稀释成0、0.020、0.040、0.060、0.080、0.100、0.120、0.140 g/L的溶液后，在每个稀释液中分别取1 mL注入试管内，在每个试管中加入1 mL的70 %的乙醇，再向每个试管中加入5 %的NaNO2溶液0.5 mL后进行混匀并静置6 min，再向各试管中加入质量分数10 %的Al(NO3)3溶液0.5 mL，混匀后在静置6 min，再次向各试管中加入质量分数为4 %的NaOH溶液2 mL，混用后静置15 min。最后通过紫外分光光度器进行510 nm波长吸光值的测定，每个样品3次重复。⑤番茄样品溶液总黄酮质量分数的测定。将1 mL样品溶液放入试管内，加入φ=70 %的乙醇1 mL及0.5 mL质量分数为5﹪的 NaNO2溶液，混匀，6 min后加入0.5 mL质量分数为10 %的 Al(NO3)3溶液，混匀后在静置6 min，再次向各试管中加入质量分数为4 %的NaOH溶液2 mL，混用后静置15 min。最后通过紫外分光光度器进行510 nm波长吸光值的测定，每个样品3次重复。计算番茄叶片类黄酮质量分数。

计算公式：x=[C×V1×V2/V3]×100 %/m，式中，x为样品中类黄酮质量分数；C为通过回归方程计算的样品溶液质量浓度，(g/L)；V1为样液体积，mL；V2为样品定容体积，mL；V3为通过显色反应测定的样品溶液的体积，mL；m为样品量，mg[14]。

2 结果与分析

2.1 转基因番茄植株的获得及分子鉴定

利用含有pBI121-sikP的农杆菌GV3101浸染番茄下胚轴15～20 d后，下胚轴两端伤口处能分化出淡黄色愈伤(图1A、B)，继续培养能长出绿色芽点，并再生出小芽( 图1C)。将小芽切下转到1/2MS生根培养基上，20～30 d 后长出较发达的根系( 图1D)，对无菌苗进行PCR(图2)和RT-PCR( 图3)检测，说明sikP基因已整合到番茄体内并能够转录。将鉴定为阳性的无菌苗移栽至深18 cm、直径20 cm的花盆中，在培养室中生长(图4)作为实验材料。

A：番茄下胚轴；B：抗性芽的再生；C：再生芽生根；D：再生植株的移栽图1 转基因番茄再生及抗性植株筛选Fig.1 Regeneration of transgenic tomato and selection of resistant plantlet

2.2 转基因番茄和总黄酮质量分数的测定

2.2.1 标准曲线的制作 将稀释不同浓度的芦丁溶液通过紫外分光光度器进行510 nm波长吸光值的测定，以芦丁的不同浓度作为横坐标，以检测的不同浓度标准品的吸光值A作为纵坐标进行标准曲线的绘制。求得回归方程为：C=115.72OD510+ 0.0938，相关系数R2= 0.9959，其中，C为黄酮的浓度，单位为g/L(图5)。结果表明，标准曲线具有良好的线性关系。

M: DNA marker Ⅲ；1：阳性对照；2：阴性对照；3～7：转基因番茄图2 转基因番茄sikP基因PCR扩增结果Fig.2 PCR results of sikP in transgenic tomato

M: DNA marker Ⅲ；1～5：转基因番茄；6：阴性对照；7：阳性对照图3 转基因番茄sikP基因RT-PCR扩增Fig.3 RT-PCR results of sikP in transgenic tomato

图4 转sikP基因番茄Fig.4 Transgenic tomato of sikP gene

2.2.2 最大吸收波长的测定 取适量的样品溶液，加入5 %亚硝酸钠溶液，通过硝酸铝进行显色，再进行420～700 nm波长扫描，最终进行最大吸收波长的确定。番茄样品溶液通过通过硝酸铝进行显色后再进行420～700 nm波长扫描，结果显示在510 nm波长时吸光值最大，为此选择510 nm波长进行后续吸光度值的测定。

2.2.3 番茄总黄酮质量分数的测定 对转基因番茄和对照组番茄的样品提取液经过显色反应后，通过紫外分光光度器进行510 nm波长吸光值的测定，结果表明：和对照组相比转基因番茄总黄酮质量分析明显提高，转基因组是对照组的5.4倍(表1)。

3 讨 论

一般来说转录调控因子通过调控次生代谢来调节植物的生长发育，通过在类黄酮代谢途径的研究发现，拟南芥、矮牵牛、玉米和水稻等植物中具有多个调控活性的转录因子[15]。目前根据DNA结合结构域的特点进行转录因子的分类，分为7大家族：b-HLH( Basic-helix-loop-helix)家族、WRKY家族、MYB家族、WD40家族、homeodomain家族、WIP家族和 bMADS家族[16-18]，与类黄酮代谢相关的主要是MYB家族、bHLH家族和WD40家族的转录因子。这3种转录因子一般是相互作用的，它们通过形成MYB-bHLH-WD40复合体的形式来调节相关基因的表达来调控类黄酮代谢通路。比如MYB家族转录因子通过调节 WD40和 bHLH的表达来调控调控类黄酮代谢通路。但是某些MYB转录因子通过单独调节类黄酮代谢通路上的节点基因的表达来促进类黄酮的合成[19-24]。与类黄酮合成相关的MYB家族转录因子最早被发现的植物是玉米，玉米P基因是MYB家族转录因子，该基因通过在墨西哥甜玉米中的过表达试验，表明P基因通过调节CHS和DFR基因的表达来调控类黄酮的合成[25-27]。截止到目前，人们从植物中已经克隆了100多个MYB家族转录因子，并进行了功能的分析。结果显示，与类黄酮合成相关的MYB家族转录因子蛋白并不都是转录激活因子，也存在负调控的转录因子从而抑制相关基因的表达。例如，人们在拟南芥中克隆的R3型MYB转录因子蛋白AtMYBL2和R2R3型MYB转录因子AtMYB60，可有效的促进花青素的合成[28-30]。而在银杏中克隆的MYB转录因子GbMYBF2，对其进行拟南芥的遗传转化和功能分析发现该类是负调控类黄酮的合成[31]。

图5 类黄酮测定标准曲线Fig.5 Standard curve of flavonoids determination

图6 天山雪莲类黄酮提取液紫外扫描图Fig.6 Scanning curve of extractive from Sasussured involucrata by U.V

样品Samples吸光度OD510质量浓度(g/L)Conter.of flaonoids质量分数(%)Contentof flaonoids质量分数平均值(%)MeanCK(对照)0.0170.0390.0282.06104.60673.33400.00340.00770.00560.0056sikP(转基因)0.1310.1950.14415.253122.659216.75750.02540.03780.02790.0304

本文所研究的sikP基因属于R2R3亚家族的MYB转录因子，和水母雪莲SmP基因结构类似，那么sikP基因是否具有调控类黄酮次生代谢途径的作用呢。是转录激活因子还是负调控类黄酮的合成呢。因此，通过对天山雪莲sikP基因的植物过表达载体pBI121-sikP，经农杆菌介导，遗传转化番茄，再采用分子手段进行鉴定，获得转基因番茄，最后对其类黄酮含量进行初步检测。结果显示，与对照组番茄相比转基因番茄类黄酮质量分数显著提高，转基因番茄类黄酮质量分数是对照组番茄的5.4倍，这将为以后对实现天山雪莲类黄酮物质人工合成研究奠定基础，是解决天山雪莲资源匮乏的有效方法之一。