青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的克隆、序列分析及原核表达

2018-08-04徐齐君王玉林原红军曾兴权尼玛扎西

西南农业学报 2018年6期

徐齐君，扎桑，王玉林，原红军，曾兴权，尼玛扎西

(1. 西藏自治区农牧科学院农业研究所,西藏拉萨 850002; 2. 省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室,西藏拉萨 850002; 3. 西藏自治区农牧科学院,西藏拉萨 850002)

【研究意义】青稞(HordeumvulgareL. var. nudum HK.f.)为禾本科大麦属，又名裸大麦、米大麦，为藏族人民主要粮食作物。青稞主要生长在海拔高、温度低、日照长、昼夜温差大的地区，对环境的抗逆性较强[1]。近些年来，研究者们先后对青稞的抗盐性[2-3]、抗旱性[4-5]等方面进行了研究，以期明确青稞的抗逆机制，筛选出有应用价值的基因，为提高青稞的产量和质量，选育出抗逆性强的优良品种提供理论依据。【本研究切入点】在前期研究中，采用转录组测序和抑制性差减杂交技术对青稞的抗寒相关基因进行了筛选，其中，核糖体蛋白基因RPL19(GeneBank登录号: AK361587)位列其中[6]。【前人研究进展】核糖体蛋白主要有70S和80S 2种类型，70S存在于细菌、线粒体和叶绿体中，分50S和30S 2个亚基；80S核糖体存在于真核生物的细胞质中，分60S和40S 2个亚基[7]。研究表明，核糖体蛋白除组成核糖体参与蛋白质合成外，还通过参与复制、转录、RNA加工、DNA修复等作用于细胞的分裂、增殖、分化、发育调控等多种生命过程[8-10]。【拟解决的关键问题】对得到的青稞RPL19基因的初步分析显示，该基因编码一个50S叶绿体核糖体蛋白。为进一步了解该基因的相关信息，以青稞为材料，进行RPL19基因的克隆、序列分析及原核表达，旨在为进一步了解RPL19的功能，明确其与青稞的抗寒相关性方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

青稞种质‘喜马拉雅8号’和‘青稞320’由西藏自治区农牧科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 青稞种苗转录本的提取及反转录取适量的青稞种子播种于富含有机质的盆栽土壤中，正常浇水管理，待植株生长至正常大小时，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鲜叶片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit进行反转录，cDNA样本-20 ℃保存。

1.2.2HbRPL19基因的克隆以转录组测序分析结果为基础，利用Primer Premier 5.0 软件设计特异引物RPL19-F：5′- ATTGCGGGATCCATGCAGTCTTTAGTGC -3′，RPL19-R：5′- ATCTCGCTCGAGTCAT TTCTTGAGTGCATTC -3′，下划线分别为BamH I和XhoI酶切位点。RT-PCR反应在S-1000 Thermal Cycler进行，反应体系采用20 μl PCR扩增体积：TaqDNA聚合酶(TaKaRa，5 U/μl) 0.2 μl，10×PCR反应缓冲液(Takara) 2 μl，dNTP(10 mmol/L)1.6 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA 2 μl，灭菌水12.6 μl。反应条件：94 ℃变性4 min，94 ℃变性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34循环；72 ℃延伸10 min。回收目标片段，克隆、测序。

1.2.3HbRPL19基因的生物信息学分析利用NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)、ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PredictProtein(https://ppopen.rostlab.org/)、NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等网络资源对HbRPL19进行序列分析。根据推测的HbRPL19氨基酸序列，利用MEGA5.1软件进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。

1.2.4 原核表达载体的构建及转化挑选测序正确的阳性克隆提质粒，采用BamHI和XhoI分别双酶切阳性重组质粒和表达质粒pET-28a(+)，凝胶回收目标片段，使用T4DNA连接酶与16 ℃连接过夜，挑单克隆震荡培养后提质粒，酶切鉴定阳性重组质粒。将鉴定正确的阳性质粒pET28a-RPL19转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，同时将提取的空载体pET-28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)作阳性对照，BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照。

1.2.5 蛋白的诱导及检测分别挑单克隆接种于5 mL LB液体培养基(含Kan 100 μg/mL)，37 ℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1 mL按1∶100比例接种于含Kan的LB液体培养基中；将培养的100 mL培养液分为2份，其中1份加IPTG诱导表达，另1份不加IPTG作为对照，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养8 h。取IPTG诱导后菌液1 mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100 μl生理盐水及5×SDS上样缓冲液25 μl，100 ℃煮沸10 min，离心，取上清进行SDS-PAGE。对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况。同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照。

2 结果与分析

2.1 HbRPL19基因的克隆

以电子克隆延伸得到的序列(GeneBank登录号: AK361587)为基础设计特异引物，扩增青稞苗期叶片的cDNA，获得1个条带654 bp的cDNA序列(图1)，测序分析显示该片段为预期的HbRPL19基因CDS全长。

图1 HbRPL19基因扩增结果Fig.1 Amplification of HbRPL19

2.2 HbRPL19基因的序列分析

用ORFfinder在线分析显示，HbRPL19基因CDS全长654 bp，编码1个217个氨基酸的多肽(图2)。ProtParam分析表明，HbRPL19基因编码的多肽相对分子质量为24.47 KD，理论等电点(pI)为10.42，分子式为C1082H1791N327O302S8，总平均亲水性(GRAVY)为-0.353，不稳定系数为53.46，编码的217个氨基酸中，包括21个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)，40个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)，其余氨基酸为非极性、疏水性氨基酸和极性、中性氨基酸，表明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白。Disphos预测表明，HbRPL19存在29个磷酸化位点(包括12个丝氨酸磷酸化位点，13个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点)，其中，只有1个丝氨酸磷酸化位点有功能(第86个氨基酸)。应用InterProScan和NCBI网站的Conserved domains分析显示，HbRPL19蛋白存在典型的SH3-like结构域和核糖体蛋白L19结构域(图3)。

图2 HbRPL19基因的CDS序列和推测氨基酸序列Fig.2 CDS and amino acid sequence of HbRPL19

图3 HbRPL19蛋白的结构域分析Fig.3 Domain analysis of HbRPL19 protein

图4 HbRPL19的系统进化分析Fig.4 Systematic evolutionary analysis of HbRPL19

TMHMM预测该蛋白不含跨膜转移功能区。Signal IP3.0 预测该蛋白没有信号肽，不属于分泌蛋白。PredictProtein亚细胞定位证实该基因所编码蛋白位于叶绿体内。

Blastn分析发现，HbRPL19基因序列与山羊草、二穗短柄草、小米和高粱等植物的RPL基因全长cDNA序列相似度分别为94 %、87 %、85 %和84 %，推导的氨基酸序列同源比对分析结果表明，该基因与小麦、山羊草、二穗短柄草、水稻、小米等植物相似度分别为94 %、93 %、82 %、74 %、72 %。基于氨基酸序列的系统进化树表明，青稞HbRPL19蛋白(GeneBank登录号：BAJ87120)与小麦和山羊草具有较近的亲缘关系(图4)。

NPS二级结构预测结果显示，72个氨基酸属于α螺旋，占33.18 %；50个氨基酸为延伸链，占23.04 %；19个氨基酸属于β折叠，占8.76 %；76个氨基酸属于无规则卷曲，占35.02 %。应用SWISS-MODEL建立该蛋白的三级结构，如图5 所示。

2.3 HbRPL19基因的原核表达

利用BamH I和XhoI双酶切重组质粒，结果切出的片段与预期大小相同(图6a)，进一步的测序分析显示，HbRPL19插入片段完全正确，未发生任何碱基突变。将重组质粒导入BL21(DE3)后，经IPTG诱导8 h后收集菌体进行SDS-PAGE分析，结果显示融合蛋白诱导成功，与预期大小(24.47 KD)相近，融合蛋白主要存在于菌体沉淀中，上清中含量极少(图6b)，表明得到的HbRPL19诱导蛋白主要以包涵体形式存在。

3 讨论

中国国土面积辽阔，地形复杂，培育适于各种极端环境条件且高产优产的农作物是我们持之以恒的目标。青稞可以在青藏高原高海拔高寒的极端条件下生长良好，对环境有优良的适应性，同时青稞自身具有一定的保健价值。因此，对于青稞这一特殊种植资源的利用具有很大的价值。同时，由于青稞属禾本科，研究其遗传背景对于选育高产优产抗寒的农作物具有重要意义。

a中h:α螺旋，e:延伸链，t: β折叠，c:无规则卷曲h: alpha helix, e: extended strand, t: beta turn, c: random coil图5 HbRPL19蛋白的二级结构和三级结构预测Fig.5 Prediction of secondary structure and tertiary structure of HbRPL19 protein

图6 pET28a-RPL19重组质粒的双酶切和重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 Double digestion of recombinant plasmid pET28a-RPL19 and SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

叶绿体核糖体是植物特有的细胞器核糖体，主要功能是作为一个平台，在这个平台上，mRNA，tRNA和各种蛋白合成因子相继组装，来执行译码和催化肽链的合成，负责着质体基因编码的不到100个蛋白的合成。叶绿体核糖体由30 S和50 S两个亚基构成，包含rRNA和50～100种独特的蛋白[7]。在组成和行使功能的方式上，叶绿体核糖体与细菌的70 S核糖体非常相似，大部分叶绿体核糖体蛋白在大肠杆菌核糖体中都可以找到同源蛋白，其大约有45 %的平均序列一致性[11-12]。目前，叶绿体核糖体中rRNAs已经被完全确定，核糖体蛋白的功能也逐渐开始了相关研究[13-19]。顾志敏等[20]首次从单子叶的模式植物水稻中克隆了核糖体蛋白质S7基因，证明核糖体蛋白质在进化过程中的高度保守性。Yao等[21]成功分离了小麦中的15个核糖体蛋白质基因，并分析了其序列特性并进行了表达模式的检测。本研究克隆得到的青稞HbRPL19属于叶绿体核糖体50 S亚基的组成蛋白，其功能尚不清楚。我们在采用转录组测序和抑制性差减杂交技术对青稞的抗寒相关基因进行筛选的过程中发现，HbRPL19包含其中，推测其与青稞的抗寒性相关。因此，对HbRPL19基因进行了进一步的克隆和序列分析，同时，进行了原核表达，探究其在体外的表达情况。