花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体

韩占品，任 健，于玮玮，范夕玲，李 慧*

(1.天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2.天津农学院基础科学学院，天津 300384)

【研究意义】花椰菜，又称菜花、花菜或椰菜花，是十字花科芸薹属一年生植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，其营养价值和药用价值极高，在消费市场占有重要地位。在我国花椰菜属于外来种，本身种质资源匮乏[1]，且近几年我国很多地区土壤盐渍化及干旱问题日益严重，干旱和高盐碱已成为限制花椰菜品质和产量的主要因素。ERF转录因子作为植物特有的一类转录因子，其家族成员可以通过识别和特异性结合GCC-box，在植物抵抗生物和非生物胁迫过程中发挥重要的作用[2]。【前人研究进展】近几年，AP2 /ERF 家族转录因子已在多种植物中被克隆和鉴定，大量研究表明过表达ERF可以提高植物的抗逆性。过量表达番茄TERF1基因可以提高其耐旱耐盐性[3]，烟草NtERF5过表达可以提高其对烟草花叶病毒的抗病性[4]；在烟草中过表达大白菜BrERF11[5]和辣椒CaERF5[6]通过水杨酸，茉莉酸和乙烯途径介导抗病基因的表达，从而提高烟草对青枯病的抗病性；小麦TaERF3转录因子的过表达，可以提高小麦的耐盐和耐旱性[7]；杨树ERF76的过表达可以上调胁迫相关基因的表达并提高ABA和GA的合成，从而提高了杨树的耐盐性[8]。【本研究切入点】AP2 /ERF 转录因子是一类植物特有的重要转录因子超家族，其参与植物生长发育和各种逆境环境胁迫响应过程[9]。根据AP2结构域数量和识别序列不同, 该家族被分为5个亚家族: AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist[10]。其中ERF是植物特有的一类重要转录因子，其家族成员均含有一个由57～66个保守的氨基酸残基组成的AP2 /ERFDNA结合域[11]。其结构域包含3 个β 折叠和1个α螺旋，在植物增强抗病性和非生物胁迫耐性中起重要作用。【拟解决的关键问题】研究表明，ERF是参与植物的生物和非生物胁迫诱导的功能基因，本研究克隆了1个花椰菜的ERF转录因子，采用生物信息学方法对其进行预测分析，构建其表达载体，为后续花椰菜ERF转录因子功能及调控机制研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

花椰菜“津品70”，由天津市科润蔬菜研究所孙德岭研究员惠赠。

高保真酶Primer Star DNA聚合酶，DNA凝胶回收试剂盒，质粒DNA小量纯化试剂盒，M-MLV反转录酶，限制性内切酶NheΙ等均购自大连宝生物公司； pENTRSD /D-TOPO，LR ClonaseTMEnzyme Mix购自Invitrogen公司；大肠杆菌菌株 DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司；农杆菌菌株LB4404由南开大学陈德富教授惠赠；总RNA提取试剂盒购自上海普洛麦格生物产品有限公司；引物合成和测序有上海生工测序公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取和反转录 按照总RNA提取试剂盒的操作说明提取花椰菜叶片总RNA，经NanoDrop核酸定量检测仪检测其纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，按照反转录说明书合成cDNA第一链。

1.2.2ERF114全长cDNA引物设计及RT-PCR基因的扩增 利用primer premier 5.0软件设计ERF114基因的特异性引物，根据Gateway技术构建表达载体的要求，在引物5' 端加上CACC。引物序列如下：

ERF114-F: 5′CACCATTTTCTCGAATTGAATGA TTTGGGCCC3′

ERF114-R: 5′CTGATTTGTG TGTGCCTCGGTT ACG3′

采用高保真酶Primer Star DNA聚合酶进行PCR扩增，反应程序：98 ℃预变性30 s，然后进行35 个循环：98 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环结束后72 ℃ 10 min 延伸反应，4 ℃保温。2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.2.3 花椰菜ERF114蛋白序列的生物信息学分析 利用生物信息学软件，对花椰菜ERF114蛋白的氨基酸组成和理化性质、亲/疏水性、跨膜结构域、磷酸化位点、二/三级结构和功能结构域进行预测和分析(表1)。

1.2.4 利用Gateway技术构建花椰菜ERF114基因的表达载体 ① BP反应。将PCR产物与入门载体pENTRSD /D-TOPO进行BP重组反应，反应体系：目的基因PCR产物3 μl， 盐溶液1 μl，水1 μl，入门载体pENTRSD /D-TOPO 1 μl，轻轻混匀Mix后，室温反应10 min，然后取2 μl热激法转化大肠杆菌感受态，涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB筛选培养板上，37 ℃过夜培养，挑取单克隆于不含抗生素的LB液体培养基中扩繁6～8 h，后进行菌液PCR鉴定，并送生工测序验证获得重组质粒。② LR反应。

表1 生物信息学分析软件及在线分析工具

M：1000 bp marker ；1：ERF114基因图1 ERF114基因全长编码序列的扩增Fig.1 Amplification of the full-length coding sequence of ERF114 gene

反应体系：入门载体4 μl，目的载体2 μl，TE Buffer 2 μl，LR ClonaseTMEnzyme Mix 2 μl，25 ℃ 反应1 h后，加入1 μl蛋白酶K溶液，37 ℃反应10 min终止反应。取3 μl反应产物热激转化大肠杆菌感受态。将转化的细胞均匀涂布于含50 mg/L 卡那霉素的LB筛选培养基上，37 ℃培养12～16 h，挑取单克隆于LB液体培养基中扩繁6～8 h，后进行菌液PCR鉴定。鉴定正确后获得过表达载体。

2 结果与分析

2.1 ERF114基因的克隆

以花椰菜子叶cDNA第一条链为模板，用高保真酶Primer Star DNA聚合酶进行PCR扩增，得到了约680 bp左右的cDNA片段(图1)，长度与预期的一致。

2.2 花椰菜ERF114基因序列的生物信息学分析

2.2.1ERF114系统进化分析 用DNAMAN将花椰菜的转录因子ERF114与油菜(Brassicanapus，XP_013718191.1)、甘蓝(Brassicaoleraceavar.oleracea，XP 010273830.1)、白菜(Brassicarapa，XP_018515123.1 )、萝卜(Raphanussativus，XP_018489632.1)、山嵛山菜(Eutremasalsugineum，XP_006394454.1)、天蓝遏蓝菜(Noccaeacaerlescens，JAU35442.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana，NP_196348.1)、拟南芥琴亚种(Arabidopsislyratasubsp.lyrata，XP_002866459.1)、天蓝遏蓝菜(Noccaeacaerμlescens，JAU62998.1)、荠菜(Capsellarubella，XP_006279688.1)和亚麻荠(Camelinasativa，XP_010457918.1)等物种的ERF转录因子的蛋白序列进行比对，发现花椰菜ERF114的氨基酸序列与油菜ERF114的高度一致。对该蛋白的功能结构域进行分析(图2)，结果显示其含有1个AP2 /ERF保守结构域，进一步证实了该转录因子属于ERF亚家族。从图3显示，ERF114的AP2结构域具有1个保守的WLG和YRG元件，第14位为丙氨酸(A)，19位为天冬氨酸(D)，符合典型的AP2/ERF转录因子的特征。进一步构建同源进化树(图4)，结果表明其与油菜的ERF位于同一进化分支，亲缘关系最近，与其他植物的ERF的氨基酸序列亲缘关系稍远。

2.2.2 ERF114蛋白的理化特性和功能位点分析 使用在线软件ProtParam,对花椰菜ERF114进行一级结构预测，结果表明：ERF114 蛋白等电点为5.45，分子量为25425.61Da；脂肪系数为48.01，平均疏水性为-1.006；蛋白质不稳定系数为65.01，当蛋白质不稳定系数>40时，蛋白质不稳定。由于蛋白质亲/疏水性是氨基酸结构预测和功能分析的指标。采用在线软件ProtScale对花椰菜ERF114蛋白进行亲/疏水性分析(图5a)，结果显示，花椰菜ERF114大部分氨基酸属于亲水性氨基酸，说明花椰菜ERF114蛋白质结构可能是不稳定的。TMHMM 预测该蛋白的跨膜结构，结果发现该蛋白有一个跨膜区(图5b) 。进一步利用Predictprotein对ERF114蛋白进行磷酸化位点(图6)分析，结果显示该蛋白具有19个丝氨酸(Ser)，6个苏氨酸(Thr)和2个酪氨酸 (Tyr)磷酸化位点。

2.2.3 花椰菜ERF114蛋白的结构特征及蛋白功能分析 利用Predictprotein对ERF114蛋白进行二级结构预测，结果表明(图7a)，花椰菜ERF114蛋白的二级结构中α-螺旋占30.09 %，β-折叠占12.39 %，环肽链占6.64 %和无规则卷曲结构占50.88 %。进一步利用 CPHmodel对ERF114进行三级结构(图7b)预测和分析，结构表明该蛋白主要由无规则卷曲，α-螺旋结构，β-折叠及环肽链组成，其预测结果与所预测的二级结构一致。利用ProtFun 2.2 Server对该蛋白进行功能结构域预测(表2)，结果显示转录调控占1.095 %，生长因子占10.337 %，其他功能所占比列较低。说明花椰菜ERF114蛋白很可能主要参与转录调控和植物生长发育的过程。

图2 花椰菜ERF114蛋白功能结构域分析Fig.2 Functional domain analysis of cauliflower ERF114 protein

图3 花椰菜ERF114蛋白与其他物种中ERF蛋白的氨基酸序列比对分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of ERF114 protein in cauliflower and other species

图4 不同物种中ERF114同源基因系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ERF114 homologous genes in different species

2.3 Gateway克隆技术构建花椰菜ERF114的表达载体

2.3.1 BP重组反应 将用高保真酶扩增获得的花椰菜ERF114基因片段与入门载体pENTRSD /D-TOPO进行 BP 重组反应。得到的产物转化大肠杆菌 DH5α感受态，长出的菌落进行菌液PCR检测(图8a)。结果表明，所挑取克隆均为阳性，提取质粒，单酶切后(图8b)作为入门载体。

2.3.2 LR反应 入门载体和目标载体在LR ClonaseTMEnzyme Mix 作用下进行LR重组反应，取2 μl反应产物转化大肠杆菌感受态，卡那霉素(50 mg/mL)

+ 为亲水性信号，-为疏水性信号图5 花椰菜ERF114氨基酸序列的亲/疏水性(a)和跨膜结构分析(b)Fig.5 Pro/hydrophobic (a) and transmembrane structure analysis (b) of the amino acid sequence of cauliflower ERF114

图6 花椰菜ERF114蛋白磷酸位点分析Fig.6 Analysis of phosphate site of cauliflower ERF114 protein

图7 花椰菜ERF114蛋白二级结构(a)和三级结构(b)预测分析Fig.7 Analysis of secondary structure (a) and tertiary structure (b) of cauliflower ERF114 protein

M：1000 bp marker；a：1～3为阳性克隆；b:1未切质粒；2～3 单酶切质粒图8 BP反应菌液PCR鉴定图(a)及阳性质粒酶切图(b)Fig.8 BP reaction bacteria PCR identification (a) and the positive plasmid cleavage map (b)

M：1000 bp DNA marker；1～9：ERF114-S/A引物PCR检测；10～18：35S/ERF114-A引物PCR检测图9 农杆菌重组质粒阳性克隆PCR检测Fig.9 PCR detection of recombinant plasmid positive clones of agrobacterium tumefaciens

筛选后挑取单克隆摇菌并用目的引物和组合引物进行菌液PCR 检测(图9)。结果表明，目的引物和组合引物PCR获得的条带大小和预期相符，说明目的片段成功重组到目标载体pEarleyGate 103中，植物表达载体pEarleyGate 103- ERF114构建成功。

3 讨 论

近年来，随着社会经济的飞速发展，全球环境问题日趋严重，花椰菜在栽培过程中受到了一定程度的干旱、低温、盐碱等逆境胁迫，这些对花椰菜的品质和产量会造成一定程度的影响。AP2/ERF转录因子在生物和非生物胁迫响应应答方面发挥重要作用，因此，对花椰菜AP2/ERF转录因子结构和功能的预测研究，可为研究花椰菜抵御和适应逆境机制，培育抗逆新品种奠定重要基础。

ERF是AP2/ERF家族的一个亚家族，广泛存在于植物中，含有一个由60～70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域，其结构域的第14和19为丙氨酸和天冬氨酸[12]，主要通过特异性识别GCC盒在植物抵抗生物胁迫过程中发挥重要作用。本试验成功地克隆了花椰菜转录因子ERF114，通过生物信息学手段对所获得花椰菜ERF114基因的保守结构域进行分析，结果显示ERF114具有一个AP2结构域，具有YRG和MLG保守区域，其二级结构具有3个β-折叠和1个α-螺旋结构，且第14和19位氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸。其符合AP2/ERF 保守结构域的典型特征。结构决定功能，仅仅知道基因和氨基酸序列并不能充分了解蛋白质的功能，蛋白质空间结构的研究越来越重要。通过ProtParam预测得到该蛋白不稳定系数为65.01，是一种亲水性蛋白，具有一个跨膜结构，其可能是一个不稳定蛋白。对ERF114进行功能预测发现其可能主要参与植物的生长发育及转录调控过程。

Gateway克隆技术是一种新型的通用型克隆技术，其主要利用λ噬菌体体外位点特异性重组的特点构建载体，Gateway主要通过BP和LR 2个反应将目的基因构建到表达载体中[13-15]。该技术于传统的构建载体的方法相比，整个过程中不需要内切酶和连接酶的，能更加高效快速地构建植物表达载体。本试验通过该方法成功的构建了花椰菜ERF114的植物表达载体，为今后ERF114基因的功能研究奠定了基础。

4 结 论

本研究从花椰菜中克隆获得了一个花椰菜ERF转录因子，将其命名为：ERF114，该基因全长为681 bp，编码226个氨基酸，具有一个AP2结构域，其结构域的第14 和19位氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸。同源性分析和系统进化分析结果表明，ERF114与油菜(XP_013718191.1)在同一进化分支上，亲缘关系最近。生物信息学分析结果显示，该蛋白分子量为25.42 kDa，等电点5.45，是一种不稳定的亲水性非分泌蛋白。二/三级结构分析显示该蛋白具有3个α-螺旋和1个β-折叠。为进一步探究花椰菜ERF114的功能，运用Gateway克隆技术通过BP和LR反应成功构建了植物表达载pEarleyGate 103-ERF114。