益生菌联合制剂预先灌胃对急性感染性脑损伤小鼠抑郁样行为的改善作用

徐娜娜，李聪，潘智华，顾兵2,

(1徐州医科大学医学形态实验学分中心，江苏徐州 221004；2徐州医科大学医学技术学院；3徐州医科大学附属医院)

急性感染性脑损伤为一种严重危害儿童和成人健康的感染性疾病，是由各种化脓菌引起的以脑膜炎症为主的中枢神经系统感染性疾病，发病率与年龄有关，婴幼儿多见[1]；革兰阴性菌是其常见的病原体，脂多糖(LPS)是革兰阴性杆菌产生的内毒素，进入机体后可以产生强烈的免疫炎症反应，为此病的主要致病因子。腹腔或侧脑室注射LPS，可以诱导动物出现厌食、疲劳、快感缺乏、体质量减轻和睡眠障碍等一系列抑郁样行为[2]。目前，LPS诱导小鼠抑郁的动物模型已成为研究抑郁症与免疫炎症关系及评价抗抑郁药物的重要动物模型[3]。随着抗生素和糖皮质激素的广泛使用，急性感染性脑损伤的发病率已明显减少，但仍有较高的病死率和致残率。抑郁症是一常见的精神疾病，严重危害人类健康，随着生活节奏的不断加快和社会竞争的日益加剧，世界卫生组织预测到2020年抑郁症将成为全球残疾负担的第二大原因[4]。近年越来越多的研究[5]发现，感染性脑损伤的炎症反应与抑郁症的发生发展密切相关。益生菌是一类主要定植于人体肠道、生殖系统内，对宿主机体健康有益的低致病性或无致病性微生物，可以是单一菌株制成，也可以是多种菌的复合制剂[6]。近年来以多种益生菌为基础所制备的各种联合制剂受到越来越多的关注。研究[7]发现，多种益生菌的联合制剂具有很好抗炎、抗氧化、清除自由基等生物活性。此外，益生菌联合制剂还可以调节一系列与精神疾病有关的行为，包括抑郁样行为[8]。那么益生菌联合制剂对LPS诱导的小鼠抑郁行为是否有保护作用，目前研究较少，且效应机制亦不十分明确。本研究观察了益生菌联合制剂预先灌胃对急性感染性脑损伤小鼠抑郁样行为的改善作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 益生菌联合制剂、试剂及行为学实验系统 益生菌联合制剂(包括双歧杆菌、乳酸菌、乳糖和酵母等成分的多种益生菌的混合制剂)，已申请国家专利，专利号为ZL2015104679586，购自南京伯恩立施生物科技有限公司。IL-6、TNF-α单克隆抗体及LPS购自美国Sigma公司。行为学实验系统为ZH-ZFT型自主活动实验视频分析系统(淮北正华公司)，活动箱大小为500 mm×500 mm×300 mm，采用Anymaze system4.72软件(Stoelting公司)记录分析。

1.2 实验动物及分组 清洁级雄性健康ICR小鼠36只，3周龄，体质量8～11 g，由徐州医学院实验动物中心提供。36只小鼠随机分为益生菌组、脂多糖组、对照组，每组12只。

1.3 益生菌联合制剂应用方法及急性感染性脑损伤模型制备 各组小鼠适应性喂养后，益生菌组预先灌胃100 mg/(kg·d)的益生菌联合制剂2周，末次给药1 h后，益生菌组和脂多糖组均腹腔注射1 mg/kg的LPS制备急性感染性脑损伤模型(小鼠出现立毛、上睑下垂或嗜睡等表现说明造模成功)；对照组腹腔注射等量生理盐水。

1.4 小鼠抑郁样行为评价 制模6 h后，应用ZH-ZFT型自主活动实验视频分析系统记录与分析各组小鼠的抑郁样行为。用Anymaze system软件将活动箱空间平均划分为9个区域。先将小鼠置于明亮的旷场活动箱中适应2 min取出，再从活动箱的中央位置放入，记录其5 min的行为学指标，包括活动时间、总路程(总活动度)、轨迹、区域分布，对运动总路程和穿格次数进行统计分析。再将小鼠置于黑暗的闭场活动箱中，同样方法记录相应行为学指标。

1.5 海马组织IL-6、核转录因子κB(NF-κB)表达检测 采用蛋白质印迹法。各组小鼠抑郁样行为评价完成后，每组取6只立即处死，取脑组织，在冰上分离出大脑皮质，存放于冻存管，-80 ℃冰箱保存备用。将脑组织中加入裂解液，匀浆后，以12 000 r/min在4 ℃条件下离心15 min，所得上清即为胞质蛋白提取液。胞质蛋白用4×蛋白处理液配制成等浓度的蛋白样品。取等量蛋白样品10%SDS-PAGE分离后，以湿转移法转至NC膜上，脱脂牛奶室温封闭2 h，加入抗体孵育后洗膜，显色后条带扫描、分析及打印。目的蛋白表达量以免疫印迹中各目的蛋白条带的灰度值与内参β-actin的比值来表示。

1.6 海马CA3区神经元计数 采用焦油紫染色法。取各组剩余6只小鼠，动物麻醉后多聚甲醛灌注，快速取脑后固定24 h。石蜡包埋，切片机切片(5 μm)。采用焦油紫染色，37 ℃下染色15 min，70%酒精分色，脱蜡后中性树脂封片，观察并计数海马CA3区1 mm2区域中存活的神经元。

2 结果

2.1 各组小鼠抑郁样行为比较 ①活动轨迹：对照组小鼠旷场和暗场实验中活动轨迹复杂，多处于四角和四边区中，中央区相对较少；脂多糖组小鼠活动轨迹简单，基本没有进入中央区；益生菌组小鼠活动轨迹的复杂程度居于前两组之间，分布特点依然是周边区多，中央区少。②活动距离、穿格次数：各组小鼠制模6 h后旷场、闭场实验中自主活动路程和穿格次数比较见表1。

表1 各组小鼠制模6 h后自主活动路程和穿格次数比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与脂多糖组比较，△P<0.05。

2.2 各组小鼠大脑海马组织IL-6、NF-κB相对表达量比较 益生菌组IL-6、NF-κB相对表达量分别为0.61±0.04、0.41±0.03，脂多糖组分别为1.03±0.06、0.68±0.07，对照组分别为0.04±0.08、0.38±0.01，益生菌组、对照组分别与脂多糖组比较，P均<0.05。

2.3 各组小鼠海马CA3区神经元存活数比较 对照组小鼠CA3区神经元数目多，排列整齐、紧密，细胞形态饱满，结构完整，边缘清晰；而脂多糖组小鼠CA3区神经元数目相对较少，排列紊乱、疏松，细胞形态差，结构不完整，基质疏松及空泡形成，细胞存活数明显低于对照组；与脂多糖组比较，益生菌组CA3区神经元存活数显著提高。益生菌组、脂多糖组、对照组神经元存活数分别为(132±5.97)、(51±4.31)、(146±6.78)个，益生菌组、对照组分别与脂多糖组比较，P均<0.05。

3 讨论

急性感染性脑损伤是由各种化脓菌引起的以脑膜炎症为主的中枢神经系统感染性疾病，常会导致患者认知障碍和抑郁行为等，此病治疗困难，严重影响患者身心健康[9]。目前，临床上主要针对感染性脑损伤导致的后遗症进行治疗，主要包括高压氧、康复训练及营养脑神经等，但尚无特效药提前干预[10]。因此，积极探索减轻脑损伤的药物具有重要意义。关于感染性脑病导致抑郁样行为的病因和发病机制至今没有完全阐明。细胞因子是免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，可调节细胞生理功能，根据其在炎症反应中的作用不同可分为促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子[11]。自Maes[12]提出抑郁症的细胞因子假说后，大量研究论证了抑郁行为常伴有免疫激活，表现为炎症细胞因子分泌增多；且免疫激活也会引起个体情绪和行为的改变。因此，细胞因子可被看作是抑郁症的生物标记物[13]。

益生菌是一组寄生于人体肠道的正常菌群，通过生物拮抗改善宿主肠道菌群生态平衡、刺激肠黏膜内皮细胞分泌的分泌型免疫球蛋白而发挥免疫增强作用，从而达到提高寄生宿主健康状态的微生物[14]。临床常用的益生菌有乳酸杆菌、粪链球菌、枯草杆菌、婴儿双歧杆菌、酪酸梭菌、酵母菌、肠球菌和蜡样芽孢杆菌等菌株[15]。虽然不同种属的菌株效果并不完全一致，但大多数的研究表明益生菌对人类和动物有广泛的影响，且多种益生菌联合使用效果更为突出。有研究[16]发现，含有瑞士乳杆菌和长双歧杆菌的益生菌联合制剂降低了动物和人类的焦虑性行为，同时也逆转了大鼠心肌梗死后的抑郁样行为[17]。此外，婴儿双歧杆菌可以减轻外周血中促炎细胞因子和色氨酸浓度，从而发挥抗抑郁样行为作用[18]。研究[19]发现，添加益生菌的早期肠内营养可在一定程度上减少重型颅脑损伤所致炎症反应，降低患者血清中NF-κB、IL-6水平。

旷场、闭场实验是反映大鼠在新环境中探究行为及情绪的方法，可用来测试动物中枢神经系统的兴奋或抑郁状态[20]。穿格数及直立次数表示小鼠的探究行为，动物实验结果显示，脂多糖组小鼠空间认知能力降低，对新环境的适应能力减弱，紧张程度增高，小鼠在陌生环境中的自主活动和探究行为减少，表现为抑郁样。在本实验中，腹腔注射LPS可以引起小鼠抑郁样行为，表现为小鼠旷场自助活动减少，穿格次数较少，而益生菌可显著改善小鼠旷场的自主活动。闭场实验中，虽然自主活动距离没有显著差异，但脂多糖组穿格次数明显减少，说明注射LPS后，小鼠有抑郁样溜边的表现，探究行为明显减少，而益生菌对这种现象有明显的改善作用。

LPS是革兰阴性杆菌产生的一种内毒素，进入机体后可以通过激活NF-κB，诱导产生各种炎症细胞因子，IL-6是该过程中产生的一种关键促炎症细胞因子[21,22]。现有研究表明，IL-6在抑郁症的发病过程中发挥了重要作用。临床抑郁患者常表现出IL-6升高，常用的抗抑郁药氟西汀可明显降低小鼠脑组织与血清IL-6的表达[23]。NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，其在机体中通常以p50-p65二聚体形式与抑制性蛋白IκB结合，呈非活化状态[24]。当机体受到外界刺激(如LPS)后，NF-κB与抑制蛋白解离，变为活化状态，活化的NF-κB可促使IL-6、TNF-α等炎症因子分泌增加，引起免疫炎症反应,进而可能导致抑郁症的发生[25]。本研究显示，小鼠腹腔注射LPS后，大脑海马组织中IL-6和NF-κB表达较对照组升高；而益生菌联合制剂可显著降低LPS引起的小鼠海马组织IL-6和NF-κB表达升高。本研究还显示，益生菌能够提高小鼠海马神经元的存活率，证明益生菌可减轻LPS导致的小鼠抑郁样症状与保护海马神经元损伤有关。

总之，益生菌联合制剂可改善急性感染性脑损伤小鼠的抑郁样行为，机制可能与其可降低IL-6、NF-κB表达及抑制海马神经元损伤有关。