酶比色法测定乳粉中的胆碱含量

◎ 黄高琳

（广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300）

胆碱又称维生素B4，是一种强有机碱，分子结构式为HOCH2CH2N+(CH3)3，在酸碱条件下均不稳定，但对热稳定。胆碱在动物的正常生长和发育过程中非常重要，对促进神经发育有极其重要的作用。胆碱在食物中的存在形式为游离和酯化胆碱，如磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂。作为营养强化剂，胆碱可以促进婴幼儿大脑发育，因此出生后摄入足量的胆碱对婴儿发育至关重要。胆碱的添加含量具有一定的限制，因此开展乳粉中胆碱的测定非常重要[1-2]。

婴幼儿乳粉中胆碱的测定方法有酶比色法、雷氏盐比色法、离子色谱法等，每种检测方法都存在一定的优点和缺点。酶比色法操作简便、重复性好、检出限低、对试验人员安全，但酶价格较高。雷氏盐比色法操作繁琐、试剂有一定毒性，但成本较低。离子色谱法检出限低、回收率高、精密度好，但是设备购买维护成本高。本文采用法酶比色法对市售婴幼儿乳粉进行检测，并做出研究与探讨[3]。

1 试验仪器与试剂

试剂：99.5%酒石酸氢胆碱、过氧化物酶（美国SIGMA）、胆碱氧化酶（美国SIGMA）、磷脂酶（美国SIGMA）、4-氨基安替吡啉、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠和苯酚。除特殊指明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2008规定的一级水。

仪器：紫外可见分光光度计（岛津UV2550）、电子天平（Mettler Toledo ML204/02）、电热恒温水浴锅（HWS-26）和pH计（雷磁PHSJ-3F）。

2 实验方法

2.1 样品处理

称取5 g左右乳粉试样于50 mL的离心管中，加入1 mol/L的盐酸30 mL，拧紧盖子，涡旋1～2 min使奶粉充分溶解。置于70 ℃的水中水解3 h，取出冷却至室温。用氢氧化钠溶液调整pH值在3.5～4.0，用水定容至50 mL后混匀，过滤，静置。

2.2 显色与测定

分别取250 μg/mL胆碱标准使用溶液2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶，用水定容至刻度，配制成50、100、150、200 μg/mL的标准工作液。各取0.100 mL标准工作液、0.100 mL水于25 mL比色管，加入3 mL发色剂。

另取两个试管（A和B），分别加入0.100 mL的样品滤液，将3.00 mL的蒸馏水加入试管A之中，将3.00 mL的发色剂加入试管B之中。用塑封保护膜将两个试管盖住，混匀，放入37 ℃的水中保温15 min，取出待其冷却至室温后在波长505 nm处测其吸光度，同时蒸馏水做空白。以胆碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为A=0.003 2x-0.010 5，相关系数R2=0.999 1，线性良好。

图1 乳粉中胆碱的标准曲线图

3 结果与讨论

3.1 回收率与精密度

本方法操作简便、精确、检出限为1 mg/100 g。取羊奶粉5 g三份，分别加入2.5、5、7.5 mg，重复试验3次，胆碱回收率为95.3%～106.1%。同一种样品取样6次，分别测胆碱，精密度为1.28%

表1 胆碱精密度表

3.2 市售国产奶粉中胆碱

2017年4月—2017年9月随机采购市面上流通的40种品牌88批次的国产婴幼儿奶粉，进行胆碱含量的分析检测。依据GB 10765-2010《婴儿配方食品》和GB 10767-2010《较大婴儿和幼儿配方食品》，婴幼儿配方乳粉中胆碱含量应在1.7～12.0 mg/100 kJ范围内。所抽取的88批次产品，胆碱含量最低为2.68 mg/100 kJ，最高为11.6 mg/100 kJ，均在国家标准规定的范围内。

表2 市售婴幼儿配方乳粉胆碱含量统计表

3.3 实验注意事项

实验应当注意以下几点：①乳粉样品应充分涡旋溶解，并且在水解过程时时摇动，避免结块。②实验过程中尤其要注意水解温度，温度过低样品水解不充分，温度太高又会导致胆碱损失，因此要严格控制水解温度。③胆碱氧化酶受热受潮极易变质结块，取样时应处于干燥阴凉的环境中，用后应立即置于-20 ℃冰箱中并密封保存。④调节pH值先采用高浓度的氢氧化钠溶液（500 g/L）粗调，当pH值接近3.5时再以低浓度的氢氧化钠溶液（40 g/L）微调，避免pH超出范围。⑤发色剂应现用现配，若颜色变粉红则不能使用[4]。

4 结论

胆碱在生物体之中具有不可代替的基本功能，能促进脂肪的分解，传递神经信号，无论对于婴幼儿还是成人都有十分重要的作用。人体本身就具有合成胆碱的功能，但是人也需要从膳食中获取胆碱。越来越多的乳粉生产企业将胆碱作为营养强化剂添加进乳粉中，因此对胆碱的检测分析就成为了必要工作。酶比色法测胆碱操作比较简便、线性良好、检出限低、精密度高，用此方法检测市面上88批次乳粉，没有发现不合格，表明企业在此方面质量控制良好。