鳄鱼肠中一株乳酸菌分离鉴定及活性物质的初步分析

◎ 张小玉，邓素娥

（东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，广东 东莞 523000）

乳酸菌是一群能利用可发酵碳水化合物主要产乳酸的革兰氏阳性细菌的通称[1]，主要包括乳杆菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）等属。乳酸菌一般被视作是安全的，甚至可以改善人体和动物的健康，历来被用作食品的天然生物防腐剂。本文从鳄鱼肠道中分离得到1株潜在乳酸菌，对其活性物质进行初步研究，为进一步筛选微生物的天然抑菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 分离样品

鳄鱼肠。

1.2 指示菌

用于抗菌活性的指示菌：大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌和黑曲霉，均购买于广东微生物所。

1.3 培养基

MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂18.0 g和天然海水1 000 mL，pH6.2～6.4，121 ℃灭菌20 min，用于乳酸菌的培养纯化。

改良MRS培养基：在MRS培养基的基础上加0.3%CaCO3[2]，用于乳酸菌的分离筛选。

MRS液体培养基：用于乳酸菌的发酵。

营养琼脂培养基：蛋白胨20 g、牛肉浸出粉5 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌15 min，用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的培养。

加3% NaCl营养琼脂培养基：蛋白胨20 g、牛肉浸出粉5 g、氯化钠35 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌15 min，用于副溶血性弧菌的培养。

胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基：胰酪胨15.5 g、植物蛋白胨5.0 g、氯化钠5 g、酵母粉6.5 g、琼脂15.0 g和蒸馏水1 000 mL，pH 7.1～7.5，121 ℃灭菌20 min，用于单核细胞增生李斯特氏菌的培养。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯粉6.0 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g和蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，用于黑曲霉的培养。

1.4 乳酸菌的分离筛选

无菌操作，用灭菌海水冲鳄鱼肠表面2～3次，晾干水分，在无菌工作台称25 g样品，用灭菌剪剪碎后加入到装有225 mL无菌水的锥形瓶中（瓶中预先放一定数量的小波珠），振动摇晃30 min，即为稀释度10-1的样品液，吸取10-1稀释液1 mL加到盛有9 mL灭菌海水的试管内，摇匀，制成10-2稀释液，同样方法，稀释到10-3、10-4。用移液枪分别吸取各稀释样液100 μL到改良MRS培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，于30 ℃恒温培养48 h。挑选周围溶钙圈较明显的单菌落，在MRS固体培养基中纯化培养，反复划线，直至获得纯的单菌落。用接种环挑取纯化单菌落于1.5 mL灭菌离心管里，加入1 mL 20%甘油，然后在涡旋器上涡旋30 s，待菌充分分散，于-20 ℃冰箱中保存，备用，共分离4株。

1.5 菌株E02分类学地位鉴定

1.5.1 形态学鉴定

将筛选出的菌株接种于MRS培养基上，30 ℃恒温培养48 h。观察固体培养基上菌落的形状、颜色等特征。挑取菌体进行革兰氏染色，用普通光学显微镜观察染色结果。

1.5.2 生理生化反应测定

按照东秀珠[3]的方法，对菌珠E02进行生理生化试验。

1.6 抑菌活性物质初步分析

1.6.1 菌株E02发酵液制备

用接种环挑取1环单菌落于MRS液体培养基中，37 ℃静置发酵培养48 h，然后在10 000 r/min离心20 min[4]，得到发酵上清液，用酸度计测定发酵液的酸度，并记录。

1.6.2 乳酸对照液制备

将MRS液体培养基用1 mol/L的乳酸调至与原发酵上清液相同pH值，即为对照液。

1.6.3 指示菌菌悬液制备

指示菌菌悬液制备采用光电比浊计数法，在含有指示菌的斜面上加入适量无菌生理盐水，在涡旋器上充分涡旋，制成高浓度的菌悬液，再移入50 mL的大试管中，加入适量的无菌生理盐水进行稀释，用分光光度计（波长为600 nm）测OD值，使菌悬液的OD值为0.5，然后按每100 mL冷却至50 ℃左右的指示菌培养基接种1 mL OD值为0.5的指示菌悬液。

1.6.4 牛津杯双层平板法[5]测抑菌活性

2.0 %的素琼脂冷至50 ℃左右，按每平皿7 mL倾倒在无菌平皿中，待凝固后，用无菌镊子取2个已灭过菌的牛津杯摆放在倒有素琼脂的平皿中，再倾倒含有指示菌的培养基，待凝固后，用镊子拔去牛津杯。在其中一个牛津杯的孔中加入约200 μL无细胞发酵上清液，另外一个牛津杯的孔中加入对照液，在4 ℃冰箱中扩散4 h，置于适宜的培养条件下培养一定时间后观察是否有抑菌圈，并测量其大小，抑菌圈越大，代表该菌株抑菌能力越强。

大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌37 ℃培养12 h，黑曲霉28 ℃培养48 h。

1.6.5 原发酵上清液与相同pH对照液抑菌活性的比较

对比原发酵上清液与相同pH对照液的抑菌圈大小，对抑菌活性进行初步分析。

2 结果与分析

2.1 菌株E02分类学地位鉴定

2.1.1 形态学鉴定

菌株E02菌落呈圆形上凸状、光滑、白色、湿润，边缘较整齐。菌株E02为短杆、无芽孢的革兰氏阳性菌，其显微形态如图1所示。

图1 菌株E02的显微形态图

2.1.2 生理生化鉴定

菌株E02最适合生长温度为30 ℃，其生理生化特征见表1。菌株E02经过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、产硫化氢实验、吲哚实验均呈阴性。通过东秀珠编著的《常见细菌鉴定手册》比对，菌株E02初步鉴定为乳杆菌。

表1 菌株E02生化鉴定特征表

2.2 抑菌活性物质初步分析

由表2可知，菌株E02既可抑制革兰氏阴性菌（大肠杆菌和副溶血性弧菌）又可抑制革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌），但对真菌（黑曲霉）并没有抑菌作用。

由表2和表3对比可知，说明抑菌作用是酸和非酸性物质共同作用结果，其主导抑菌作用主要来源于其产生的酸，只有少部分是其他活性物质。

表2 菌株E02原发酵上清液的抑菌圈直径表（单位：mm）

表3 乳酸对照液抑菌圈直径表（单位：mm）

3 讨论

改良MRS培养基，在MRS培养基的基础上加0.3%CaCO3，此条件下分离到菌落出现溶钙圈的现象，有利于乳酸菌的分离筛选，CaCO3是一种很好的指示剂。

该实验成功地从鳄鱼肠道中分离到1株对常见食品腐败菌具有抑菌活性的菌株，菌株E02既可抑制革兰氏阴性菌（大肠杆菌和副溶血性弧菌）又可抑制革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌），但对真菌（黑曲霉）并没有抑菌作用。

通过用乳酸调节与原发酵液相同pH的MRS液体培养基，并与原发酵液作抑菌活性对比，排除乳酸作用，菌株E02发酵液仍然具有抑菌效果。在以后实验中，希望能进一步的研究，确定它们是何种物质。