大豆NIP类水孔蛋白基因的鉴定及表达特性分析

吴 伟，冯志娟，徐盛春，刘 娜，张古文，胡齐赞，龚亚明*

(1.浙江省种子管理总站，浙江 杭州 310020；2.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

DOI: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.07.01

水孔蛋白(aquaporins，AQPs)，是多基因编码的多功能膜蛋白，通过形成运输通道，介导胞内或胞间物质(水分等)选择性跨膜转运，调控细胞渗透压[1-2]。AQPs蛋白具有高度保守的结构序列，由6个跨膜螺旋组成，N-端和C-端都位于细胞质中。其中，6个跨膜螺旋由5个亲水环(Loop A、B、C、D、E)相连组成，A、C和D环位于膜外，B和E环为位于膜内，并且在B环和E环上分别有一段由3个氨基酸组成的高度保守序列NPA(天门冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸，Asn-Pro-Ala)，各自翻转成半个跨膜螺旋，向内膜折叠形成“水漏模型”，参与AQPs蛋白活性的调节[3]。依据氨基酸序列的同源性及亚细胞定位的不同，AQPs可以被划分为多个亚类：质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins，PIPs)，主要定位在质膜；液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins，TIPs)，主要定位在液泡膜；类根瘤菌26膜内在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)，类根瘤菌26蛋白(NOD26)是植物中第一个被发现的AQP蛋白，定位在大豆与根瘤菌的共生体膜上；小分子膜内在蛋白(small basic intrinsic proteins，SIPs)，主要定位在内质网膜等[4-5]。众多AQPs亚类的发现及功能鉴定表明，不同亚类的AQPs，生物学功能各不相同[6]。

NIPs亚类水孔蛋白，具有底物转运广泛性，不仅可以转运水、尿素、甘油等小分子物质，还对硼、砷、硅等非金属元素具有渗透性，参与植物逆境胁迫应答过程[7-8]。拟南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1[9-10]、水稻OsNIP3;1[11]、大麦HvNIP2;1具有转运硼酸的作用[12]。水稻OsNIP2;1和OsNIP2;3[13-14]、玉米ZmNIP2;1和ZmNIP2;2具有转运硅元素的作用[15]。过表达拟南芥AtNIP1;2能够提高植株对铝胁迫的耐受力[15]；AtNIP3;1和AtNIP7;1提高植株对砷胁迫的耐受力[16-17]。然而，关于大豆NIPs基因的功能仍知之甚少。

菜用大豆(vegetable soybean)，属大豆(GlycinemaxL. Merr)的专用型品种，主食嫩荚和籽粒，富含氨基酸、维生素、纤维素等，具有极高营养价值，是一种新兴的特种蔬菜。近年频发的自然干旱，严重制约了菜用大豆产量的提高和品质的提升。本研究拟利用已知的拟南芥NIPs序列，开展对大豆NIPs染色体定位、蛋白结构、进化关系、基因结构、组织表达模式及干旱应答的研究，为进一步研究该亚类基因成员的功能及抗旱分子改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 大豆NIPs的鉴定

首先，利用水孔蛋白保守结构域的隐马氏模型(Pfam号码：PF00230)和NIP亚类水孔蛋白的通路模型(KEGG号码：K09874)[18]；接着，利用HMMER3.0软件，分别搜索大豆基因组数据库Phytozomev11.0，获得候选大豆NIPs。进一步，利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batch.pl)和 CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对检索到的候选NIPs蛋白序列进行逐一确定；同时，参考已知的拟南芥、玉米和水稻NIPs蛋白序列信息[19-21]，手工去除冗余序列和不含有NIP特征结构域的序列，获得大豆NIPs的蛋白序列。最后，利用Phyre v2.0软件对大豆NIPs蛋白的3D结构进行预测[22]。

1.2 大豆NIPs系统进化树的构建

根据已获取的大豆NIPs蛋白序列，利用 ClustalW2 进行蛋白多序列比对。利用MEGA6.0软件的邻接法NJ(neighbor-joining)构建NIP的系统进化树[23]。进化树分支上的数值表示重复1 000次出现的次数。

1.3 大豆NIPs基因结构的分析

从大豆基因组数据库Phytozomev11.0分别获取NIPs的DNA序列和CDS序列，利用GSDS在线工具对所有大豆NIP进行内含子-外显子组成分析[24]。

1.4 大豆NIPs基因结构的分析

从大豆基因组数据库中选取NIPs基因起始密码子上游1 500 bp的DNA序列作为启动子区段，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线工具进行顺式作用元件分析。

1.5 大豆NIPs基因的不同组织表达分析

利用大豆NIPs基因的ID，直接从大豆基因组数据库Phytozomev11.0获取NIPs基因在9种不同组织(根、茎、叶、花、种子、豆荚、发根、根瘤、顶端分生组织)的GeneAtlas Tissue Sample表达数据即芯片表达数据[25]。进一步，利用TreeView程序分析不同NIPs基因的表达特征[26]。

1.6 菜用大豆干旱胁迫处理

以菜用大豆种子(种质编号GMLN012012017)为实验材料，每盆播种4粒，置于22 ℃光照培养箱中培养 (16 h/8 h，光/暗)。将长势相近的3周大幼苗根部用20% PEG 6000浸泡处理，处理时间为0.5、1.5、6.0、12.0 h，选取相同时间段未处理的样品作为对照组，分别取整株幼苗置于液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.7 实时定量RT-PCR分析

利用天根的RNAsimple总RNA提取试剂盒进行菜用大豆植株RNA提取。利用天根的FastQuantcDNA第一链合成反转录试剂盒进行cDNA合成，均一化后作为实时定量PCR模板。利用KAPA SYBR®FastqPCR试剂盒进行荧光定量PCR，以GmActin11作为内参基因[27]。其中，GmNIP1;5正向引物序列F： ATAACAGAGCGGTTGGTGAG，反向引物序列R: GGCTTCTAGCTGGGTTCATT。PCR总反应体系为20 μL，经预实验优化后PCR反应程序为：第一步，1个循环，95 ℃预变性10 min；第二步，40个循环，95 ℃ 7 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s；绘制熔解曲线，0.2 ℃·s-1。试验设置3次生物学重复。采用相对定量2-ΔΔCt方法计算NIP基因在干旱处理下某个时间点相对于对照的转录水平变化[28]。

2 结果与分析

2.1 大豆NIPs的全基因组鉴定

在大豆基因组中搜索到13个NIPs基因(表1)：分布在10条大豆染色体上，其中，第2和8号染色体上都有2个NIPs基因，其他染色体上各含有1个NIPs基因。蛋白质生化属性分析发现：最长的序列有296个氨基酸残基(NIP7;1)，最短的序列有261个氨基酸残基(NIP4;1和NIP4;2)；其中等电点范围从6.41(NIP1;5)到9.61(NIP1;1)，分子量范围从27.59 ku(NIP4;2)到31.42 ku(NIP7;1)。保守结构域比对分析显示，所有NIP均含有典型的6个跨膜结构(TM1-TM6)和2个NPA结构域(图1)。同样，3D结构分析显示，所有NIP均含有由5个环连接形成的6个保守跨膜螺旋结构(图2)。

2.2 大豆NIPs的生物进化

为了解大豆NIPs的进化关系，利用大豆GmNIPs与已知的拟南芥AtNIPs、玉米ZmNIPs和水稻OsNIPs蛋白全长序列构建了系统进化树(图3)。结果显示：不同物种NIPs基因进化分支并不完全一致，每个进化分支并不是同时含有这4个物种的NIPs基因成员。其中，大部分GmNIPs与拟南芥AtNIPs的进化关系更为接近(GmNIP5;1和GmNIP6;1 除外)。说明大豆和拟南芥、水稻、玉米的物种分化可能早于NIPs基因的分化。

表1 大豆NIPs的鉴定及特性

TM1-6代表跨膜结构域。TM1-6 represented trans-membrane domains.图1 大豆NIPs蛋白的保守结构域Fig.1 Conserved domains of soybean NIPs

图2 大豆NIPs蛋白的3D结构Fig.2 3D structure of soybean NIP proteins

2.3 大豆NIPs基因结构

内含子-外显子结构在基因家族进化中起重要作用。13个大豆GmNIPs基因启动子分析显示(图4)：所有GmNIPs均含有5个外显子和4个内含子；然而，不同NIPs基因成员的上游和下游序列长度各不相同，紧挨上游和下游的两个外显子的长度各不相同，内含子长度各不相同，暗示不同的GmNIPs基因表达调控模式可能存在差异。

2.4 大豆NIPs基因启动子元件

基因上游启动子中所含作用元件可以反映其是否参与相应逆境和激素应答过程。13个大豆GmNIPs基因启动子分析显示(表2)：77%的成员在启动子区域含有HSE(heat stress responsive element)作用元件(与高温有关)；69%含有MBS作用元件(与干旱有关)；69%的成员含有TC-rich repeat元件(与逆境胁迫有关)；23%的成员含有LTRE(low temperature responsive element)作用元件(与低温有关)，这4类元件都与逆境胁迫应答有关。此外，大豆GmNIPs基因启动子中69%含有TGA(auxin-responsive element)作用元件；62%的成员含有CGTCA(MeJA-responsive element)作用元件；54% 的成员含有ERE(ethylene-responsive element)作用元件；54%含有GARE(gibberellin-responsive element)作用元件；46%的成员在启动子区含有ABRE(ABA-responsive element)作用元件；38%的成员含有TCA(salicylic acid-responsive element)作用元件，这6类元件都与激素应答有关。暗示大豆GmNIPs基因参与植物的逆境及激素胁迫应答过程。其中，GmNIP7;2和GmNIP4;1含有3～5个HSE元件；GmNIP4;2含有3个MBS元件；GmNIP1;5含有3个TC-rich repeat元件；GmNIP2;1分别含有3个TC-rich repeat和4个ABRE、CGTCA和TCA元件；GmNIP6;1分别含有3个CGTCA、GARE和TCA元件，说明这6个基因极有可能直接参与逆境胁迫或ABA、GA、MeJA、SA、Auxin信号应答过程。

圆形代表大豆NIPs，三角形代表拟南芥NIPs，正方形代表玉米NIPs，菱形代表水稻NIPs。The circular icons represented soybean NIPs， triangle icons represented Arabidopsis NIPs， square icons represented maize NIPs， diamond icons represented rice NIPs.图3 大豆和拟南芥NIPs的进化树Fig.3 Phylogenetic tree of the soybean， Arabidopsis， maize and rice NIP members

2.5 NIPs基因在大豆不同组织中的表达模式

从大豆数据库中收集到13个NIPs基因表达数据，结果显示：不同的NIPs基因成员，组织表达模式各不相同，仅部分基因表达量相对较高(图5)。其中，GmTIP1;5在根瘤和根毛中表达较高，GmNIP1;1在根中表达量较高，在其他组织表达量较低，提示其可能和根瘤或根的发育过程有关；GmNIP1;3、GmNIP5;1和GmNIP6;1在各个组织中广泛表达。组织表达模式的差异暗示GmNIPs基因功能发生了分化。

图5 大豆NIPs基因组织表达特性Fig.5 Expression analysis of soybean NIPs in different tissues

2.6 菜用大豆GMNIP1;5基因干旱表达谱

进一步以表达量最高的GmNIP1;5为候选基因，利用荧光定量PCR对其在干旱胁迫下的基因表达量进行了分析(图6)，结果显示：GmNIP1;5基因在干旱胁迫处理1.5和6.0 h表达量上调，说明GmNIP1;5基因参与干旱应答过程。

**表示差异极显著。** represents the significance at P<0.01.图6 大豆GmNIP1;5基因干旱表达谱Fig.6 Expression analysis of soybean GmNIP1;5 in response to drought stress

3 讨论

AQPs广泛存在于植物中，在物质(水分等)跨膜运输途径中发挥重要生理功能，是功能基因组学研究的热点内容，在农业上具有广阔的应用前景[5]。AQPs以基因家族形式存在，根据其序列相似性规律来进行分类[3]。2001年，根据拟南芥基因组信息分析，AQPs各亚类命名体系基本形成[3]。近年来，随着大量基因组数据信息的出现，大量新AQPs被发现[21-26]。本文参照拟南芥NIPs亚类基因，通过大豆全基因组分析，共鉴定到13个大豆NIPs基因(表1)，所编码蛋白均含有保守的跨膜螺旋区和NPA结构域(图1)，进一步进化关系分析发现，部分大豆NIPs与双子叶模式植物拟南芥NIPs聚集为一类，其余大豆NIPs与单子叶模式植物水稻和玉米的NIPs基因聚集为一类(图3)，推测同一进化分支的NIPs基因可能具有更相似的生物学功能。如，大豆GmNIP1;1、GmNIP1;2、GmNIP1;3、GmNIP1;4、GmNIP1;5与拟南芥AtNIP1;2处于同一进化分支，可能参与铝胁迫应答过程；大豆GmNIP3;1与拟南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1及水稻OsNIP3;1处于同一进化分支，可能参与硼酸转运过程；大豆GmNIP5;1和GmNIP6;1与玉米ZmNIP2;1和ZmNIP2;2以及水稻OsNIP2;1处于同一进化分支，可能参与硅转运过程；大豆GmNIP7;1和GmNIP7;2与拟南芥AtNIP7;1处于同一进化分支，可能参与砷胁迫应答过程。

AQPs基因的表达具有时空特异性。在有水分大量流动的植物组织和器官中表达量很高：如根表皮、外皮层和内皮层细胞、靠近木质部导管的木薄壁细胞、韧皮部伴胞、保卫细胞；在植物发育的特定阶段表达：如种子萌发、细胞伸长、花粉管伸长、维管形成时期[27]。拟南芥α-TIP在种子贮藏囊泡中特异表达，烟草TobRB7在根柱中表达，而烟草NtAQP在根中靠近维管组织细胞表达，向日葵SunTIP27和SunTIP220均在保卫细胞中表达，冰草的MIP2A在根的分生组织及木薄壁细胞中表达。本文利用生物芯片数据综合分析了大豆所有NIPs亚类基因的组织表达特异性，结果发现GmNIP1;3、GmNIP5;1、GmNIP6;1在多个组织表达；GmNIP1;1仅在根中表达；GmNIP1;5在根瘤和发根中特异表达；其余NIPs基因表达量均较低(图5)。不同NIPs基因在植物发育的不同阶段编码表达，可能与其所参与的不同生理过程相关。

AQPs基因的表达受多种逆境胁迫信号的影响。在拟南芥、水稻、玉米、白菜、油菜、马铃薯中发现，AQPs基因受干旱、高盐、低温不同程度的诱导表达[31-35]。在低温胁迫下，超表达拟南芥AtPIP1;4和AtPIP2;5基因，增强水的吸收转运和向上运输能力，从而赋予转基因株系对低温的耐受力[36]。在干旱胁迫下，过表达SlTIP2;1基因的番茄植株，与对照植株相比都具有较高的存活率和果实产量[37]。过表达小麦TaNIP可提高植株体内K+、Ca2+及脯氨酸的积累，降低NaCl含量的积累，增强植株耐盐性[38]。在硼亏缺情况下，敲除水稻OsNIP3;1基因后，会改变水稻芽尖硼的运输分配，导致水稻生长发育严重受损[39]。本文通过启动子元件分析发现，多数NIPs亚类基因含有胁迫(高温、干旱、低温)和激素(脱落酸、赤霉素、乙烯、茉莉酸、水杨酸、生长激素)应答元件；然而，不同NIPs基因成员所含元件种类和数量各不相同(表2)，说明不同NIPs基因的表达调控方式可能存在特异性。进一步利用荧光定量分析了GmNIP1;5基因对干旱胁迫的响应情况，发现其响应干旱胁迫(图6)，其具体耐逆分子机理仍需进一步的实验证实。