激光拉曼光谱无损分析浙贝母

孙彩霞，潘志彦，戴 芬，郑蔚然，于国光

(1.农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州310021； 2.浙江工业大学 环境学院，浙江 杭州 310032)

浙贝母是著名的中药材“浙八味”之一，野生浙贝母多生长在林荫处，现多为栽培。浙贝母主要分布于浙江、江苏、安徽、湖南等地，浙江的浙贝母产量最大，主要分布于宁波鄞州区和海曙区、东阳市、缙云县、磐安县、舟山市定海区等地，其中宁波鄞州区和海曙区为浙贝母的原产地。根据《中国药典》记载，浙贝母具有清热化痰止咳，解毒散结消痈等作用，用于治疗风热咳嗽、痰火咳嗽、肺痈、乳痈、瘰疬、疮毒[1]。

激光拉曼光谱是一种散射光谱，通过与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法[2-3]。拉曼效应产生于来自高能量的入射光子与样品分子振动能级之间的能量交换，产生拉曼位移。拉曼位移的程度对应于分子振动能级的跃迁。在有机物结构分析中，拉曼光谱适用于对称的键，如C—C，C=C，C≡C，N—N，S—S等，这些键在红外吸收很弱，但在拉曼散射中很强。拉曼光谱在成分分析中最大的优势是可以实现产品的无损分析和定量/定性检测，相对于现有的光谱、质谱、红外等分析方法，具有无需或者便于前处理，检测后的产品可以回收利用等优势。

药材含有丰富的官能团，一方面既与药材本身丰富的有机物有关，另一方面也与药材的产地有关。近年来，采用拉曼光谱用于对中药材产品的真伪鉴别和道地性分析比较多见，但用于浙贝母的分析比较少。本研究通过采集浙江省主要浙贝母产地的样品，进行激光拉曼光谱分析，初步建立浙贝母的拉曼光谱图谱，实现应用拉曼光谱技术无损、快速、准确、简便地鉴别浙贝母的目的，为拉曼光谱在浙贝母等中药材中的分析应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

浙贝母样品分别取自宁波市海曙区章水镇、东阳市、缙云县、磐安县、舟山市定海区等5个浙贝母主产区生产基地。样品采集时间为2017年5月份，为浙贝母采收季节。根据生产基地面积大小，每个基地采集1～3个新鲜样品，每个样品质量为500 g，共采集样品47个，主要样品的分布情况见表1。

样品采用随机取样法采集，采集后的新鲜浙贝母种球用纸巾轻轻擦拭除去泥土后，装入洁净的塑料采样袋中，放入冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2 仪器与方法

采用共聚焦拉曼光谱仪(HR800 Lab RAM，Horiba JobinYvon)及配套设备组成。光谱仪配备531.95 nm激光光源(frequency-doubled Nd∶YAG，20 mW)及CCD(charge coupled device)检测器(multichannel，air cooled)。光谱测量范围200～4 000 cm-1，曝光时间120 s。

选择表明平整，大小均匀干净的浙贝母新鲜种球，采用手术刀切片，选取切片均匀的切片，放置于载玻片上，使其位于激光显微拉曼光谱仪载物台的物镜视野下，通过微机屏幕上的影像窗口调整焦距，测定浙贝母新鲜样品表面的拉曼光谱。

2 结果与讨论

2.1 不同产地浙贝母的拉曼光谱

根据不同产地采集的浙贝母拉曼位移，去除部分样品差异比较大的样品，不同产地浙贝母的拉曼光谱位移见图1。

浙贝母富含糖类及生物碱，由于其不同的产地和品种，形成的产品中微量元素和有效成分含量的差异，形成不同产地浙贝母的拉曼光谱的指纹图谱。对比图1各图，可以看出，不同产地的浙贝母样品在475～500、2 800～2 900 cm-1呈现明显的位移。在800～2 000 cm-1处，不同产地的浙贝母拉曼光谱的位移有所差异。浙贝母可能含有D-葡萄糖、氨基葡萄糖、氘代氨基葡萄糖、氘代N-乙酰基葡萄糖。2 800～2 900 cm-1的位移为—C—H的伸缩震动，475～500 cm-1的位移为Si—O键的位移和D-葡萄糖。而在2 000～2 800 cm-1，由于荧光干扰，使得这一段的信噪比非常低[4-5]。

2.2 拉曼光谱一阶导数图谱

根据2.1节的分析，5个不同产地的拉曼光谱在800～2 000 cm-1处，不同产地的浙贝母拉曼光谱的位移差异比较大，因此选择这一阶段的拉曼光谱进行一阶求导，不同产地浙贝母的一阶导数图谱见图2。不同产地的浙贝母出现拉曼特征峰的位置比较相似，在875、912、965、1 153、1 312、1 410、1 482、1 598、1 641 cm-1位移处出现明显的特征峰，在985、1 025、1 056、1 096、1 112、1 239、1 356、1 378、1 432、1 629、1 692 cm-1位移处出现较为明显的特征峰。

图1 宁波市海曙区(A)、东阳市(B)、缙云县(C)、磐安县(D)和舟山市定海区(E)浙贝母拉曼光谱图Fig.1 Raman spectroscopic of Thunberg Fritillary Bulb from Haishu District of Ningbo City， Dongyang City， Jinyun County， Pan’an County and Dinghai District of Zhoushan City

图2 不同产地浙贝母拉曼位移的一阶导数Fig.2 First-order derivative of Raman spectroscopic of Thunberg Fritillary Bulb from different sources

2.3 浙贝母拉曼位移的归属

对比浙江省不同产地和批次的浙贝母的拉曼光谱位移图谱，以及不同种植区域浙贝母拉曼位移的一阶导数图谱，可知浙贝母新鲜种球的拉曼光谱非常稳定，在800～2 000 cm-1位移处的特征峰比较丰富。不同产地的浙贝母在475～500、2 000～2 800 cm-1以及875、912、965、1 153、1 312、1 410、1 482、1 598、1 641 cm-1位移处出现明显的特征峰。查阅文献初步得知这9处特征峰的归属[6-7]。

浙贝母的9个拉曼位移中，875 cm-1处的位移初步归属为甲基C—C键振动，912 cm-1处的位移初步归属为面外C—H变形振动，965 cm-1处的位移初步归属为环“呼吸”对称伸缩振动，1 153 cm-1处的位移初步归属为C—C(=O)—C反对称伸缩振动，1 312 cm-1处的位移初步归属为咪唑环伸缩振动，1 410 cm-1处的位移初步归属为甲酰基环伸缩，1 482和1 589 cm-1处的位移初步归属为C=C伸缩振动。通过这些官能团振动，可判断出浙贝母内所含成分，从而达到成分分析研究的目的。在不同波长处拉曼光谱的位移强度与所含成分的浓度有关，这可能由于不同产地的浙贝母生长环境及品种不同的差异所致，但拉曼光谱用于浙贝母有效成分含量的定量研究还缺乏数据支持，可以借助进一步的色谱或质谱分析进行。通过上述分析，可以初步判定浙贝母在800～2 000 cm-1位移处的9个特征峰作为浙贝母的特征图谱，作为判定这类产品的信息。

2.4 拉曼光谱在农产品无损检测分析中的应用

拉曼光谱用于农产品检测分析，具有免于样品前处理和无损分析的特点，检测方法快速、简便，样品可以回收利用，在高端农产品分析中具有良好的应用前景。现有的研究结果表明，拉曼光谱用于分析棕榈油、灵芝孢子油等农产品是否以次充好、以假乱真方面的研究已有报道[9-10]。拉曼光谱的特征位移是对被测物质进行定性检测的依据，由于每种物质含有的特征官能团对应的拉曼光谱位移缺少丰富的数据库资源，因此拉曼光谱在物质的鉴别方面缺少丰富的数据库支持，有待于充分积累特色农产品的拉曼光谱信息，作为该类物质进行拉曼光谱分析的依据。

3 结论

拉曼光谱具有无损、快速、准确、简便，以及免于前处理和所用样品易于回收的特点而广泛应用于农产品检测[8]。拉曼光谱当前已成功应用于快速鉴别药材类别、真伪、优劣及产地溯源等方面，但在浙贝母中的应用比较少。本研究首次将拉曼光谱用于浙贝母新鲜样品的检测，分析了浙江省浙贝母主产区的拉曼光谱，对比了同样产区不同生产基地和不同生产地区的浙贝母新鲜样品拉曼光谱的差异，为拉曼光谱用于浙贝母的检测分析提供了一定的实验依据。该方法亦可进一步拓展成为鉴别浙贝母真伪及产地溯源的手段。但需要更多的样品和分析方法的支持[11-12]。