DON、ZEA联合染毒对体外培养鸡脾脏淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影响

张 卓，辜彦霏，阳莎莎，王亚超，邓俊良，任志华*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2.西南科技大学，四川 绵阳 621010)

镰刀菌毒素是导致全球食品、饲料业及养殖业经济损失最大的一组霉菌毒素[1]。与家畜健康和生产有关的重要的镰刀菌毒素是单端孢霉烯族毒素，即脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，玉米赤霉烯酮(ZEA)，T-2毒素和烟曲霉毒素。由于家禽对镰刀菌毒素敏感性明显低于猪，因此家禽镰刀菌毒素中毒常表现亚临床症状而容易被忽视。霉菌毒素性质稳定，在粮食的储存和加工过程中不易被破坏，因此极易通过食物链引起人畜中毒[2]。

细胞因子可传递细胞间信息进而参与免疫应答全过程，其在免疫调控中起重要作用。国内外一些学者对DON、ZEA单独染毒对脾脏细胞因子的影响进行了大量研究，结果表明，DON、ZEA单独染毒均对细胞因子的分泌、基因表达有影响。Kinser等[3]利用芯片研究小鼠口服 25 mg·kg-1体质量的DON对其脾脏调节基因表达的作用，结果表明DON主要与免疫调节、炎症有关的基因和趋化因子有关，主要诱导IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-11的分泌。Pestka等[4]给断奶小鼠和成年小鼠以5 mg·kg-1体质量的剂量口服DON，结果DON影响了脾脏的INF-α、IL-1β和IL-6，其mRNA的表达断奶小鼠是成年小鼠的2～3倍。Marin等[5]研究ZEA对猪的中性粒细胞的免疫反应时发现细胞增殖减少，IL-8显著减少。

目前饲料受镰刀菌毒素污染非常严重，尤其在四川等南方潮湿、多雨、日照短的亚热带湿润气候地区，DON和ZEA在饲料中的检出率均严重超标[6]。因此，本实验以原代培养鸡脾脏淋巴细胞为模型，重点研究了DON、ZEA联合染毒对鸡脾淋巴细胞分泌促炎性细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影响，为进一步阐明动物DON、ZEA中毒机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系

40～60日龄健康的伊莎公鸡，购自东北农业大学动物医学院动物中心。无菌摘取鸡脾脏，放入装有PBS液的培养皿中，清洗后剥离脾脏周围结缔组织。移至盛有PBS液培养皿中200目的铜网上，用无菌的注射器内芯研磨，使脾脏淋巴细胞进入PBS液中，过滤，并稀释滤液到一定浓度。再将此细胞悬液缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，2 000 r·min-1，常温离心15 min后移取淋巴细胞。将淋巴细胞用冷的PBS液和不含毒素含血清的RPMI1640完全培养液各洗涤1次，重悬，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95%可用于后续实验。

CCK-8法分别检测了DON、ZEA致鸡脾脏淋巴细胞半数抑制浓度(IC50)，DON的IC50为(30.82±10.48) μg·mL-1，ZEA的IC50为(23.91±4.96) μg·mL-1。前期实验中DON、ZEA单独染毒时高浓度均造成脾脏淋巴细胞的严重损伤，故在正式试验中以DON、ZEA低浓度进行联合染毒。DON、ZEA联合染毒剂量为0.012 5 μg·mL-1和0.006 25 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1和0.025 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1和0.1 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1和0.4 μg·mL-1，分别设为DZ-1组、DZ-2组、DZ-3组和DZ-4组。

1.2 实验材料

胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)，Hepes、DON、ZEA及无酚红的RPMI1640培养基(Sigma，美国)，细胞计数(CCK-8)试剂盒(DOJINDO，日本)，rTaq酶等PCR反应试剂(TaKaRa，日本)，Trizol试剂盒、M-MLV反转录酶(Invitrogen，美国)，溴化乙锭(EB)(美国Sigma)，鸡的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA检测试剂盒(上海生物公司，中国)。

1.3 体外培养鸡脾脏淋巴细胞上清液中细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的测定

染毒48 h后收集细胞培养上清液，3 000 r·min-1离心20 min，吸取上清，-20 ℃保存备用。按说明书测定上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。

1.4 体外培养鸡脾脏淋巴细胞内细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表达测定

采用荧光定量RT-PCR法测定，淋巴细胞低温充分匀浆后，用Trizol试剂抽提总RNA，使用M-MLV反转录酶反转录成cDNA。根据GenBank中发表的鸡的全基因序列，应用Prime 5.0软件设计特异的上、下游引物，使用GenBank Blast同源性检索后由Invitrogen公司(上海)合成。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin的引物序列及参数见表1。在30 μL体系中进行扩增：10 μL总RNA，1 μL M-MLV反转录酶，1 μL RNA酶抑制剂，4 μL dNTP，2 μL Oligo dT，4 μL DTT和8 μL 5×buffer。42 ℃，反应30 min，99 ℃灭活5 min，5 ℃ 5 min。RT产物瞬时离心，立即使用或保存在-20 ℃备用。上述各项指标的测定重复3个不同批次的细胞，每批细胞每个样本重复3次，数据以平均值±标准差表示。

1.5 数据统计分析

应用SPSS13.0软件对数据进行显著性检验。采用REST软件分析毒素处理样品各目的基因mRNA表达丰度的差异并计算。

2 结果与分析

2.1 DON、ZEA联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影响

DON、ZEA联合染毒对上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影响，见表2。由表2可见，染毒48 h，随毒素浓度的升高，鸡脾脏淋巴细胞上清液中IL-10和IFN-γ蛋白含量均升高，蛋白含量除IL-10和IFN-γ在DZ-1组外，均显著或极显著高于空白对照组(P<0.01)；而随毒素浓度的升高，IL-2和IL-4蛋白含量降低，除IL-2、IL-4在DZ-1组、IL-2在DZ-2组外，均显著或极显著低于空白对照组(P<0.01)。DON、ZEA联合染毒48 h，除IL-4在DZ-3与DZ-4间，IFN-γ在DZ-2与DZ-3 (DZ-1组)间外，其余各组组间差异显著或极显著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA联合染毒可导致鸡脾脏淋巴细胞培养上清中IL-10和IFN-γ蛋白含量随毒素浓度的升高而增加，IL-2和IL-4蛋白含量均随毒素浓度的升高而降低，具有显著的剂量依赖关系。

表1 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin基因的引物设计

表2 DON、ZEA联合对鸡脾脏淋巴细胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影响

同列数据上没有相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

In the same column， values without the same capital letters mean that the difference is significant (P<0.01). The same as below.

2.2 DON、ZEA联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞内IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的mRNA表达的影响

DON、ZEA联合作用对鸡脾脏淋巴细胞内IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ基因的mRNA的表达，见表3。由表3可见，DON、ZEA联合染毒48 h，除IL-10在DZ-1组，鸡脾脏淋巴细胞内IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表达量均随毒素浓度的升高而升高，极显著高于空白对照组(P<0.01)；IFN-γ的mRNA表达量呈先升高后降低趋势，但均极显著高于空白对照组(P<0.01)。DON、ZEA联合染毒48 h，除IL-10在DZ-1组与空白对照组间，其余各组组间差异极显著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA联合染毒可导致鸡脾脏淋巴细胞内IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表达量随毒素浓度的升高而增加，具有显著的剂量依赖关系；IFN-γ mRNA表达量随毒素浓度的升高而先升高后降低。

表3 DON、ZEA联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞调控基因IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表达

3 讨论

DON、ZEA均可破坏机体免疫系统造成免疫抑制，它们作用于免疫系统的主要靶器官是脾脏。但目前它们对鸡脾脏功能影响的研究主要集中在脾脏相对质量、组织病理学改变方面，对细胞因子的影响多是单独毒素染毒的研究，而两种毒素联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞分泌细胞因子的影响研究较少。因此，本实验研究DON、ZEA对鸡脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响，即Thl细胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-4和IL-10)在体外培养的脾淋巴细胞的上清液中的分泌含量和细胞内细胞因子基因的mRNA的表达。

ZEA诱导人和小鼠的几个免疫指标改变，即增加IL-2和IL-5的产生，并诱导免疫抑制作用[13-15]。ZEA诱导老年鼠分泌的IFN-γ减少[16]。范小龙等[17]采用ELISA的方法测定ZEA对离体培养的小鼠淋巴细胞因子IFN-γ和1L-10分泌的影响，结果表明低浓度ZEA(1 μg·mL-1)能显著促进脾脏淋巴细胞分泌IL-l0，而高浓度ZEA(10、25 μg·mL-1)能极显著抑制脾脏淋巴细胞分泌lL-10，不同浓度ZEA均能显著或极显著抑制脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ。本实验结果与上述结果部分类似，但因不同动物对DON、ZEA的敏感性存在种属差异。所以，目前研究结果与以往的研究结果可能也会有差异。

目前单一DON或ZEA对细胞因子的影响报道较多见，而DON和ZEA联合染毒对细胞因子影响的报道较少见。Ren等[18-19]分别报道了DON和ZEA联合染毒可降低小鼠血清IL-4和IFN-γ的浓度。在我们的实验中，随着DON和ZEA联合毒素浓度的增加，鸡脾脏淋巴细胞分泌的IL-4的浓度和mRNA的表达量都是下降的；细胞分泌的IFN-γ的浓度虽然升高，但mRNA的表达量先升高后下降，预测试验时间延长后浓度也会下降。总体上，DON和ZEA联合染毒对鸡脾脏淋巴细胞分泌细胞因子的影响和Ren等[18-19]报道的DON和ZEA联合染毒对小鼠血清细胞因子影响的趋势相一致。

本实验结果表明，DON、ZEA联合染毒鸡脾淋巴细胞上调或下降促炎性细胞因子的水平。Th1和Th2细胞因子平衡失调，因此造成细胞免疫损伤，进而产生毒性。