耐多药和广泛耐药MTB的inhA基因突变与对丙硫异烟胺耐药的相关性分析

宋艳华 王桂荣 霍凤敏 刘荣梅 高孟秋 李琦

结核病目前仍是危害人类健康的重大传染病，耐多药结核病(MDR-TB)的出现和流行是目前全球结核病控制的重大挑战。世界卫生组织(WHO)估计，2016年全球约有MDR-TB新发患者60万例，而在中国估计每年MDR-TB新发约7.3万例[1]。2016年，“WHOtreatmentguidelinesfordrug-resistanttuberculosis”中推荐，在MDR-TB治疗组成方案中至少需要包括4种有效的药物[2]，但是由于耐药、治疗费用及药物不良反应等原因，选择有效的、能持续应用的药物组成方案较困难，特别是对于广泛耐药结核病(XDR-TB)。

异烟肼(INH)是治疗结核病的核心药物，其主要耐药机制是katG和(或)inhA基因突变，katG突变可造成结核分枝杆菌(MTB)对高浓度INH耐药，inhA突变菌株多为对低浓度INH耐药[最低抑菌浓度(MIC)一般为0.2～1.0 mg/L]，inhA突变是二线抗结核药物丙硫异烟胺(PTH)或乙硫异烟胺(ETH)的耐药机制之一，并且是INH和ETH/PTH交叉耐药的分子基础[3]。已有研究证明了高剂量INH治疗MDR-TB有效[4]。WHO推荐高剂量INH作为一种推荐药物用于MDR-TB的治疗[2]，主要推荐用于inhA突变导致的低浓度INH耐药的结核病患者。为此，笔者选取MDR-TB和XDR-TB临床分离株，分析其inhA突变情况与对PTH进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果间的关联性，以说明大剂量INH及PTH在耐药结核病治疗中的临床应用价值，为临床医生选择药物提供借鉴。

资料和方法

1.研究对象：选取2016年2月至2017年2月首都医科大学附属北京胸科医院确诊的132例MDR-TB或XDR-TB患者作为研究对象。研究对象临床分离株均培养阳性且鉴定为MTB，具有INH、利福平(RFP)、左氧氟沙星(Lfx)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)及PTH药敏试验结果，同时具有katG和inhA突变检测结果。

2.细菌培养及药敏试验：按照《结核病诊断实验室检验规程》对标本进行处理，并在改良罗氏培养基(购自深圳银科公司)上进行培养，培养阳性菌落采用分枝杆菌药敏检测试剂盒(购自深圳银科公司)进行菌种鉴定和药敏试验。操作方法参考产品说明，临界浓度分别为：INH 0.2 μg/ml、RFP 2 μg/ml、Lfx 2 μg/ml、Am 1 μg/ml、Cm 2.5 μg/ml、PTH 10 μg/ml，在这一浓度上生长定义为耐药。

3.基因突变检测：痰液和脓液等临床标本先经过N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠法(NALC-NAOH)去污处理；支气管肺泡灌洗液及其培养物直接取样加入提取液，经加热离心提取DNA，采用INH耐药基因突变检测试剂盒(购自厦门致善生物科技有限公司)进行荧光定量PCR熔解曲线分析[5]，记录katG和inhA基因突变结果。

4.统计学分析：采用Excel 2007软件进行数据收集，SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料采用“率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.药敏试验结果：根据表型药敏试验结果，132株临床分离菌株中MDR-MTB有89株(67.4%)、前广泛耐药结核分枝杆菌(pre-XDR-MTB，即：在对INH和RFP耐药的基础上，同时对二线注射类药物或氟喹诺酮类药物中的一种药物耐药)有26株(19.7%)、XDR-MTB有17株(12.9%)。

2.耐药基因突变情况：katG突变率(合并及不合并inhA突变)为73.5%(97/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分别为69.7%(62/89)、73.1%(19/26)、94.1%(16/17)；inhA单突变率(不含katG突变)为 15.9%(21/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分别为18.0%(16/89)、15.4%(4/26)、5.9%(1/17)。inhA+katG双基因突变率在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分别为1.1%(1/89)、7.7%(2/26)、11.8%(2/17)。

3.对PTH表型耐药与inhA突变的关系：菌株对PTH的总耐药率为22.7%(30/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分别为11.2%(10/89)、30.8%(8/26)、70.6%(12/17)。XDR-MTB对PTH的耐药率明显高于MDR-MTB(χ2=30.57，P<0.01)和pre-XDR-MTB(χ2=6.55，P<0.05)。inhA突变率(合并及不合并katG突变)在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中分别为19.1%(17/89)、23.1%(6/26)、17.6%(3/17)；inhA突变菌株对PTH表型耐药率分别为29.4%(5/17)、4/6、3/3。在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB的PTH耐药株中，分别有5/10、4/8、3/12发生inhA基因突变。无katG和inhA突变的14株菌对PTH均敏感。92株无inhA突变(单katG突变)株对PTH耐药情况有差异：MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB菌株对PTH的耐药率分别为8.2%(5/61)、23.5%(4/17)和64.3%(9/14)；XDR-MTB菌株对PTH的耐药率明显高于MDR-MTB和 pre-XDR-MTB菌株，差异均有统计学意义(χ2=20.05，P<0.01；Fisher精确概率法，P<0.05)。132株临床分离株的表型药敏试验结果与耐药基因突变的相关性见表1。可见，MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中，katG仍为主要突变基因，且从MDR-MTB到XDR-MTB突变率升高，而inhA单基因突变率降低。从MDR-MTB到XDR-MTB，对PTH耐药率明显增加，而菌株inhA突变率低于其对PTH表型耐药率。

表1 132株结核分枝杆菌临床分离株的表型药敏试验结果与耐药基因突变的相关性

讨 论

MTB对INH的耐药与许多基因突变相关，发生频率最高的是katG编码区和inhA突变，katG315突变最常见，有30%～94%耐药株发生该突变[3，6]。inhA突变包括其启动子区和编码区突变，占对INH耐药MTB菌株的8%～43%[4]，绝大多数菌株以启动子区突变为主[3]。katG和inhA在对INH耐药MTB菌株中的突变率具有地域性差异。本次研究结果显示，MDR-MTB、 pre-XDR-MTB和XDR-MTB中inhA单突变率是18.0%、15.4%、5.9%。据报道，不同地区对INH耐药MTB菌株inhA突变率(合并及不合并katG突变)不同，埃塞俄比亚为0.8%[7]，波兰为4%[8]，菲律宾为22%[9]，中国厦门为27.8%[5]。南非研究显示，MDR-MTB和XDR-MTB菌株inhA单突变率分别为14.8%和10.3%[4]。MTB菌株inhA基因突变与其对INH低度耐药和PTH高度耐药相关[3]，inhA突变而katG未突变的MTB菌株感染者可能将受益于高剂量INH的治疗。笔者本次研究结果和南非的数据都显示，随着耐药种类的增多(从MDR-MTB到XDR-MTB)，inhA单突变菌株有减少趋势，推测在XDR-TB患者常规药物治疗方案中加用高剂量INH可能受益小于MDR-TB患者[4]。

本次研究显示，MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中inhA+katG双基因突变率分别为1.1%、7.7%、11.8%，而南非地区研究显示以上3种菌株中inhA+katG双基因突变率分别为15%、43%、73%[4]，均高于本次研究结果。MTB菌株inhA基因突变是其INH、PTH/ETH交叉耐药的分子基础，南非地区研究显示，XDR-MTB有较高的ETH耐药，考虑为inhA突变所致[4]，inhA突变可作为预测MTB菌株对ETH耐药及XDR-TB的分子标识。本次研究显示，从MDR-MTB到XDR-MTB，inhA突变株对PTH的耐药率逐渐升高，但在MDR-MTB中仍有部分inhA突变菌株对PTH敏感。而且，在XDR-MTB中inhA(合并及不合并katG突变)突变率不高(17.6%)，但是对PTH耐药率为70.6%，所以不同于非洲MTB菌株特征；故本次研究中，XDR-MTB菌株中inhA突变可能不是对PTH产生耐药的主要机制。PTH与ETH作为前药，需要单加氧酶EthA蛋白激活作为活性形式(ETH-NAD或PTH-NAD)作用于inhA而发挥生物效应。inhA和ethA基因突变是MTB对ETH与PTH 耐药的主要分子机制。Tan等[10]研究显示，在46株对PTH耐药的临床分离株中，19株有ethA突变、22株有inhA(调控区或编码区)突变。Vilchèze和Jacobs[3]报道，MDR-MTB对ETH的耐药菌株中有54.2%～100.0%具有ethA突变。ethA突变也可能是XDR-MTB菌株对PTH产生耐药的主要机制。另外，Tan等[10]研究显示，MTB对Lfx耐药可能与对PTH耐药相关(OR=2.18，95%CI：1.02～4.63；P=0.04)，认为可能是MTB菌株暴露于氟喹诺酮而引起的氧自由基产生，从而诱导其发生对PTH耐药相关基因的突变。因此，未检测到inhA突变的菌株并不一定对PTH敏感，尤其在XDR-MTB中即使不存在inhA突变，常规给患者加用PTH可能无效。

本研究仍存在一定的局限和不足之处。首先，本研究是临床数据的总结，实验室只是报告有无katG突变和inhA突变，没有具体突变位点的描述，所以没能对katG和inhA突变位点及inhA基因调控区或编码区突变具体描述。熔解曲线法试剂盒是对INH耐药检测位点包括inhA94、inhA启动子区-17～-8位点突变、katG315密码子检测，研究数据katG315突变均和INH高度耐药相关，inhA突变以启动子区突变为主，并且这一启动子和编码区突变均可导致对INH的低度耐药[3]，并且均与对PTH的耐药相关。所以，虽然没有对具体位点进行描述，但是不影响检测结果临床意义的判断。第二，研究对象数量有限，且均来自笔者医院，而笔者所在医院多收治以北方为主的、全国的难治性结核病患者，就诊患者中耐药患者较多，所以数据结果可能有偏倚。

综上所述，本次研究结果显示MDR-MTB和XDR-MTB菌株对INH耐药相关的基因突变均是以katG突变为主；从MDR-MTB到XDR-MTB，inhA单突变率降低。所以，在XDR-TB中常规治疗方案加用高剂量INH可能使患者受益很小。从MDR-MTB到 XDR-MTB菌株中，对PTH耐药率明显增加，inhA基因突变率下降，未检测到inhA突变的菌株并不一定对PTH敏感，尤其是在XDR-MTB中，inhA突变可能不是菌株对PTH耐药的主要原因，建议完善其他分子检测或者药敏试验，制定个体化的治疗方案。