肺结核并发糖尿病患者血浆氧化应激水平的检测结果分析

李春玲 牛良飞 李海聪 吴康 卢水华 范小勇

肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)是结核病中最常见的类型，也是威胁人类健康的主要传染性疾病之一。据统计，全球约15% 的结核病患者并发有糖尿病(diabetes mellitus, DM)，且这个比率在未来的几十年里可能会继续增加[1]。结核感染病灶及血液循环系统中均存在着一定的氧化环境[2]，在正常情况下机体内氧化物的生成与抗氧化物的清除能力处于动态平衡之中，但当机体内产生过多的氧化物质超出其抗氧化能力，则引起氧化与抗氧化失衡状态(称之为氧化应激)[3]。并发糖尿病可加重结核病进展的风险，包括其治愈率降低、死亡率升高、耐药突变增加等[4]，但是否与氧化物的过量生成有关，相关研究还不多。本研究通过定量检测PTB患者、肺结核并发2型糖尿病(PTB-DM2)患者，及健康对照志愿者血浆中氧化物的水平，探讨PTB-DM2患者血浆氧化应激水平的变化。

材料和方法

1. 研究对象：纳入2016年2月至2017年1月上海市公共卫生临床中心收治的45例初治肺结核患者(PTB组)与28例肺结核并发2型糖尿病患者(PTB-DM2组)，2组患者按照年龄及治疗时间匹配入组；另纳入24名在我中心体检的无结核病和糖尿病症状及相关病史、无结核病密切接触史的健康志愿者作为对照组(HC组)。所有入组者除外并发肿瘤、HIV 感染或AIDS、病毒性肝炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病、内分泌功能失调及其他细菌感染者。本研究通过了上海市公共卫生临床中心伦理委员会审核，入组者均知情同意并签署知情同意书。入组者基本信息见表1。PTB组及PTB-DM2组患者的相关实验室检查指标见表2。

2.疾病诊断标准：PTB的诊断标准参照中华人民共和国2017发布的《WS 288—2017 肺结核诊断》[5]，糖尿病的诊疗参照2017版《中国2型糖尿病防治指南》[6]。

表1 基本信息在三组患者中的分布情况

注a：年龄以中位数(四分位数)[M(P25，P75)]进行描述；统计值是三组数值的比较，方法是行×列卡方检验；b：存在理论频数小于1数据，采用Fisher确切概率法

表2 实验室异常指标在PTB组与PTB-DM2组的分布

注 表中括号外数值为“患者例数”，括号内数值为“发生率(%)”；“-”：理论频数小于1，采用Fisher确切概率法

3.检测指标及方法：用肝素抗凝管采集所有受试者的晨起空腹静脉血，800×g离心10 min分离血浆后置于-80 ℃备用。总抗氧化能力(total anti-oxidant capacity，T-AOC)检测采用铁离子被还原成亚铁离子后与菲啉类物质络合的显色比色法，结果以U/ml表示；过氧化氢酶(catalase，CAT)检测采用乙酸-重铬酸钾与过氧化氢反应的显色比色法，结果用U/ml表示；血红素氧合酶-1(heme oxygena-se 1, HO-1)检测采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法，结果以ng/ml表示；还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)检测采用酶标法，利用5,5′-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)循环反应检测血浆中GSH的含量，结果以μmol/ml表示；超氧化物歧化酶(superoxide dismutae, SOD)检测采用水溶性四唑盐试剂(WST-1)法，结果以U/ml表示；丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测采用硫代巴比妥酸反应产物比色法，结果以nmol/ml表示。所有检测试剂均采购自南京建成生物工程技术有限公司，检测方法均严格参照说明书进行。

4.统计学处理：所有数据均采用SPSS 23.0软件进行分析，文中数据经Kolmogorov-SmirnovZ检验不符合正态分布，故计量资料使用“中位数(四分位数)[M(P25，P75)]”表示，假设检验方法采用非参数检验(秩和检验)，两个独立样本采用非参数检验(即Kruskal-WallisZ检验)，三组数值的比较，采用行×列卡方检验；率的比较采用χ2检验；理论频数小于1时采用Fisher确切概率法。均以P<0.05为差异有统计学意义。文中点图采用GraphPad Prism 7.0 软件制作。

结 果

结果显示，3组人群血浆中的T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD等抗氧化物的含量及MDA水平差异均有统计学意义(P值均<0.05)，详见表3。PTB组患者血浆的T-AOC、CAT、HO-1含量较HC组均明显下降，MDA水平较HC组明显升高，差异均有统计学意义(Z=-3.88，P<0.01;Z=-3.82，P<0.01；Z=-3.21，P=0.005；Z=-3.94，P=0.008)；GSH、SOD水平PTB组与HC组间差异均无统计学意义(Z=-1.27，P=0.203；Z=-0.83，P=0.406)。PTB-DM2组患者的T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD水平较PTB组患者均明显下降，MDA水平较PTB组患者明显升高，差异均有统计学意义(Z=-3.08，P=0.047；Z=-2.44，P=0.046；Z=-2.27，P=0.023；Z=-2.45，P=0.096；Z=-3.50，P=0.002；Z=-6.01，P<0.01)。3组各指标差异点状展示见图1～6。

讨 论

近年来，随着慢性炎症性疾病的高发，氧化应激与慢性炎症性疾病的研究得以广泛开展[7-8]。正常情况下，机体内产生的氧化物可很快被抗氧化系统清除，氧化物的生成与抗氧化物的清除能力处于动态平衡之中。结核分枝杆菌是一种专性需氧的胞内寄生菌，主要在宿主的巨噬细胞内生长增殖。当吞噬细胞吞噬入侵的结核分枝杆菌之后，机体在杀死病原菌的过程中会产生大量的自由基，其中羟自由基等氧化能力较强，易造成细胞及组织损伤。机体一方面需要消耗更多的抗氧化物质来维持自身氧化平衡，另一方面这些过量的自由基可通过与巯基(-SH)结合使含巯基的抗氧化剂失活，加之PTB患者自身营养状况不良，大多缺乏维生素C、维生素E等抗氧化物质[9-10]，极易导致PTB患者体内氧化物过多，抗氧化物质减少，氧化和抗氧化平衡状态被打破。PTB-DM2患者的长期高血糖可加重机体的氧化应激水平，进而反作用于患病机体使病情加重。目前，常用的检测血液氧化应激水平的保护性指标有T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD，氧化脂质损伤的指标为MDA。T-AOC是机体对抗氧化能力的总体反应；CAT具有清除体内H2O2的功能，在抗氧化过程中具有重要作用[11]；HO-1是一种诱导型胞内酶，广泛存在于多种细胞及组织中，是一种氧化应激的拮抗剂[12]；GSH是一种水溶性的抗氧化物，其活性巯基结构是重要的功能基团；SOD是能通过歧化反应将超氧化物转化为过氧化氢和氧气的一种酶，是机体强有力的抗氧化剂和自由基清除剂，在保护机体免受脂质、蛋白质及DNA损伤过程中起着重要的作用；MDA是脂质过氧化的主要代谢产物，其含量的高低可反映机体细胞受自由基攻击脂质过氧化的程度。

表3 氧化应激状态指标在不同组中的检测结果比较

注 表中计量资料不符合正态分布，使用“中位数(四分位数)[M(P25，P75)]”表示，三组数值比较采用行×列卡方检验

图1～6 不同人群血浆中T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD与MDA的检测结果。其中HC为健康志愿者，PTB为肺结核患者，PTB-DM2 为肺结核并发2型糖尿病患者。图1～3 分别可见PTB组的T-AOC、CAT、HO-1水平均低于HC组，高于PTB-DM2组。图4、5 可见PTB组的GSH、SOD水平均低于HC组，但差异均无统计学意义；但高于PTB-DM2组。图6 可见PTB组的MDA水平高于HC组，低于PTB-DM2组

本研究发现，PTB患者血浆中T-AOC、CAT及HO-1水平均明显低于HC组，提示机体感染结核分枝杆菌后，处于氧化与抗氧化失衡状态且存在脂质氧化损伤加重。有研究结果显示，与健康对照组相比，PTB组血清氧化物及脂质损伤标志物MDA含量均较高，致总抗氧化能力显著降低[13]。与本实验的研究结果一致。

本研究还发现，与单纯PTB患者相比，PTB-DM2患者的氧化应激状态更加恶化，T-AOC和其他抗氧化物水平均明显降低。提示PTB并发糖尿病后，可加剧患者机体内氧化和抗氧化失衡，机体的氧化损伤更为严重，可能与糖尿病患者胰岛素功能不全及高血糖诱发相关。有研究认为，糖尿病引发的高血糖是诱发机体产生大量活性氧(ROS)及活性氮(RNS)的主要原因，过多糖代谢产物也是加重氧化物与抗氧化系统失衡的重要因素。研究表明，胰岛素具有抗氧化的作用，其可以通过胰岛素信号通路调节各种抗氧化酶及关键转录因子的相互作用，其中包括核因子红细胞相关因子2(Nrf2)和核因子κB(NF-κB)，致ROS产生减少并促进ROS消除[14]。而2型糖尿病患者多为胰岛素抵抗伴胰岛素相对缺乏，即糖尿病患者体内的胰岛素正常功能受损，调节血糖的能力降低，可能也导致抗氧化的作用受到损伤。另外，氧化应激不仅可以破坏胰岛β细胞，抑制胰岛素的合成与分泌，还可诱导胰岛素抵抗的发生，诱发或加重糖尿病病情[1]。因此，处于氧化应激状态的结核病患者更易并发糖尿病，而糖尿病本身与氧化应激的相互拮抗将加重结核病患者体内的氧化和抗氧化动态失衡，并使其治疗效果及预后变差[15]。本研究结果表明，PTB-DM2患者的抗氧化能力降低，脂质损伤加重。

综上所述，本研究证明了PTB患者体内存在抗氧化能力的降低及脂质损伤，发现了并发2型糖尿病可以加重PTB患者的氧化应激水平及脂质氧化损伤。因此，改善机体的氧化应激状态，可能为结核病及耐药结核病的辅助治疗提供新思路。但是，由于氧化应激指标水平所受的影响因素较多[16]，需要进一步优化氧化应激生化指标的检测，加强对PTB或PTB-DM2患者的辅助诊断及预后的监测。