巴戟天水提取物对精索静脉曲张SD大鼠支持细胞波型蛋白表达的影响

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(1.泉州医学高等专科学校基础医学部解剖教研室，福建 泉州 362010；2.泉州医学高等专科学校动物实验室，福建 泉州 362010)

精索静脉曲张(varicocele，VC)是一种发生于精索内蔓状静脉丛的血管病变，是导致疼痛、不适及进行性睾丸功能减退的重要原因，也是导致男性不育的最常见原因之一[1]。支持细胞在精子的生成中具有重要作用，是为发育中的精子提供保护和营养的细胞[2]。男性不育治疗的研究一直是热点，但相关西医疗法效果不佳，近年来中医中药研究取得了一定进展。有研究发现巴戟天(morindaofficinalis)具有提升性功能强度的作用，在治疗VC中有具有较好疗效，这可能与巴戟天具有改善波形蛋白(vimentin)表达水平的作用有关，但关于其治疗机理的相关研究极少[3-4]。本文应用动物建模实验研究巴戟天水提取物对精索静脉曲张SD大鼠支持细胞波型蛋白表达的影响，探究巴戟天治疗VC的机理，为巴戟天治疗VC在临床上的推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料准备

选取处于青春期的健康雄性SD大鼠40只作为研究对象，平均体质量(195.86±13.86)g，按照数字随机表法分为假手术组(假手术组)、VC+生理盐水组(对照组)、VC+巴戟天水提取物200 mg/kg组(观察1组)以及VC+巴戟天水提取物400 mg/kg组(观察2组)，每组10只。除假手术组外，均对肾静脉给予逆行结扎，形成VC模型。在VC模型形成30 d后，观察1组、观察2组按照不同组别分别使用不同剂量巴戟天水提取物进行灌胃，假手术组、对照组使用同体积生理盐水进行灌胃，时间持续30 d。颈椎脱臼处死VC模型SD大鼠后取出睾丸，剔出膜组织，剪碎后使用D-Hanks除去清液，将组织分别使用0.25%胰蛋白酶、0.10%胶原酶I型消化，将悬浊液使用200目的细胞筛过滤，使用高速离心机离心10 min(1 500 r/min)，使用DMEM高糖培养基重悬细胞，使用细胞计数板计算细胞密度。

1.2 细胞活性检测

使用MTT法检测细胞活性，将每份细胞悬液样本于96孔板中培养，每孔加入20 μg浓度为5 mg/mL的MTT溶液，震荡30 s后在5%CO2、35 ℃条件下培养4 h。培养后吸去每孔上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解结晶物，使用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光度(absorbance，A)，细胞存活率=[(A实验组-A空白组)/(A假手术组-A空白组)]×100%。

1.3 支持细胞波形蛋白mRNA表达水平

1.3.1 总RNA提取 细胞悬液加入Trizol裂解后加入三氯甲烷震荡1 min后在0 ℃下静置5 min，并在4 ℃下离心15 min(15 000 r/min)，收集上清液分别使用异丙醇、乙醇使用离心法洗涤，最后加入DEPC水溶解得到RNA溶液。使用核酸蛋白仪检测RNA纯度，A在1.8～2.0视为RNA纯度较高。

1.3.2 使用反转录法合成cDNA 使用反转录法合成cDNA，试剂盒购买于伯乐生命医学产品(上海)有限公司，严格按照说明书操作进行。

1.3.3 引物设计 本次演技引物参照相关文献[5]，引物长度为150 bp，上游：5-ATGAAAGTGTGGCTGCCAAGAAC-3’，下游：5’-GTGACTGCACCTGTCTCCGGTA-3’。

1.3.4 检测mRNA相对表达量 使用实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR)法检测，试剂盒购买于伯乐生命医学产品(上海)有限公司，将稀释后的cDNA样本2 μL以及引物各2 μL建立反应体系(10 μL)，按照以下条件孵化，50 ℃、2 min，95 ℃、2 min，60 ℃、1 min，共进行40个循环，使用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

1.4 支持细胞波形蛋白表达水平

使用Western blotting法检测波形蛋白表达，方法如下：使用胰酶消化后使用苯甲基磺酰氟裂解细胞30 min，后在4 ℃条件下离心10 min(15 000 r/min)，收集上清液，蛋白定量方法为BCA法。配制基层胶(60 V、30 min)和分离胶(100 V、60 min)，封闭后分别加入兔抗大鼠Vimentin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵化12 h，TBST洗涤，入羊抗兔IgG(1∶3 000)，25 ℃孵化1 h，TBST洗涤，进行电泳，将电泳结果拍照，使用Quantity One软件分析波形蛋白相对表达水平。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 4组大鼠支持细胞活性比较

4组支持细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 4组大鼠支持细胞活性比较(n=10)

2.2 4组大鼠支持细胞波形蛋白mRNA表达水平比较

对照组支持细胞波形蛋白mRNA表达水平显著低于假手术组(P<0.05)，观察1组和观察2组波形蛋白mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)，并且观察2组显著高于对照组和观察1组(P<0.05)，见表2。

组别相对表达水平t/P假手术组1.00±0.00对照组0.47±0.06t1=11.435,P1=0.000观察1组0.72±0.11t1=7.867,P1=0.000; t2=7.128,P2=0.000观察2组0.89±0.12t1=3.947,P1=0.000; t2=10.464,P2=0.000; t3=5.751,P3=0.000

t1、P1:与假手术组比较；t2、P2:与对照组比较；t3、P3:与观察1组比较

2.3 4组大鼠支持细胞波形蛋白表达水平比较

支持细胞的波形蛋白表达凝胶电泳图见图1，对照组支持细胞波形蛋白表达水平显著低于假手术组(P<0.05)，观察1组和观察2组波形蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)，并且观察2组显著高于对照组和观察1组(P<0.05)，见表3。

图1 支持细胞波形蛋白凝胶电泳图

表3 4组支持细胞波形蛋白表达水平比较)

t1、P1:与假手术组比较；t2、P2:与对照组比较；t3、P3:与观察1组比较

3 讨论

VC是一种血管病变，精索内蔓状静脉丛的异常扩张、伸长和迂曲，由于包绕精索的精索静脉和蔓状静脉丛的扩张而引起的血管性精子发生障碍，不但会使患者感觉疼痛，而且导致不育，给患者、家庭和社会带来不利因素。VC在在男性不育症中占19%～41%[6]。目前对于VC的治疗主要为护理性治疗、药物治疗以及手术治疗，其中一般护理性治疗主要为饮食调节、注意生活方式、降温或阴囊托等，此类方法疗效不理想；手术方法主要为经腹股沟管精索内静脉高位结扎术、经腹膜后精索内静脉高位结扎等，虽具有一定效果，但患者选择时出于安全性考虑较为犹豫；药物治疗主要为中药治疗，疗效较好，但其治疗机理一直是研究热点[7-8]。

巴戟天为为双子叶植物茜草科，巴戟天水提取物中的主要成分为巴戟天多糖、甲基异茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚等蒽醌物质，在中医中常用于治疗主治阳痿遗精、宫冷不孕等生殖问题[9]。研究发现巴戟天可提高VC大鼠紧密连接相关蛋白的表达提高支持细胞的紧密连接作用[10]。支持细胞不是生殖细胞株的一部分，但支持细胞曲细精管中紧邻生殖细胞，为精子提供保护和营养，支持细胞不但在间质间隙与浸泡生殖上皮的液体之间起功能性屏障作用，还具有分泌介质促进精子产生和成熟、吞噬发育不良的精子、分泌睾网液促进精子的排出等作用[11]。研究发现VC导致的支持细胞发育异常是导致不育的重要原因[12]。波形蛋白具有维持细胞骨架的完整性的作用[13]。有研究显示VC大鼠的波形蛋白mRNA表达水平低于健康大鼠，提示可能由于VC导致波形蛋白表达分泌异常，导致支持细胞体积失去支持，出现胞体变小、形态异常，从而影响支持细胞功能，影响精子的生成[14-15]。

本次研究结果显示，经巴戟天灌胃治疗大鼠的支持细胞活性与假手术组相比无显著差异，说明巴戟天水提取物具有一定的安全性。对照组的波形蛋白mRNA表达水平以及波形蛋白表达水平均显著低于假手术组，验证了VC会引起波形蛋白表达异常，与过往研究结果一致[16]。观察1组和观察2组波形蛋白mRNA表达水平和波形蛋白表达水平显著高于对照组，并且观察2组显著高于对照组和观察1组，说明巴戟天水提取物具有提高波形蛋白表达的作用，随着剂量的增加，这种效果越明显。Ghaffari等[17]研究发现VC的波形蛋白表达水平显著低于健康人群，而通过治疗可使波形蛋白水平显著升高，疗效佳组波形蛋白水平升高更加显著。李容等[18]研究发现巴戟天水、醇 提物对手机辐射致大鼠生殖障碍有修复功效，且水提物效果优于醇提物。王凤娟等[19]研究发现巴戟天水提物可促进微波辐射大鼠睾丸的修复和促进精子生成,巴戟天醇提物可改善损伤的大鼠睾丸生精细胞的形态,而对精子的生成作用不明显，但可显著下调下丘脑GnRH的表达提示巴戟天水提取物中的活性成分可通过提高波形蛋白的表达促进支持细胞的生长分化，保持支持细胞正常的大小、形态，恢复支持细胞功能，并恢复支持细胞与生精细胞间的连接，从而治疗VC导致的不育症状[18-20]。综上所述，巴戟天水提取物具有提高VC大鼠支持细胞波形蛋白mRNA表达水平和波形蛋白表达水平的作用，并且对细胞活力无明显影响。