RADA-16自组装多肽的合成表征及负载BMP-2的细胞相容性研究

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(海南医学院第一附属医院关节创伤外科，海南 海口 570102)

骨缺损因自体骨移植受到自体骨源有限的限制，往往不能达到完全填充骨缺损区所需要的骨量，随着骨组织工程技术的发展，人造骨组织填充材料不断出现，其可以填充骨缺损区域并促进缺损区域骨生长愈合，提高治疗效果，缩短治疗时间[1]。骨形态发生蛋白2(BMP-2)具有原位成骨和异位成骨作用，目前大量的实验和临床资料表明BMP-2具有较强的骨诱导活性，能诱导间充质干细胞(MSC)向骨细胞转化，从而促进骨缺损的修复[2]。但是大剂量BMP-2价格昂贵，半衰期短，且容易异位成骨，具有潜在风险，因而限制了BMP-2在临床中的应用。

目前国际上常用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米微球包载技术存在包封率不理想等问题，且包封过程中需要使用氯仿，氯仿有生物毒性，这也限制了PLGA缓释微球的使用。RADA-16是目前研究较成熟的自组装纳米短肽材料，具有自组装成胶容易控制、无细胞毒性、可被吸收、无免疫原性等特点[3]。有研究证明，RADA-16胶体的纳米网状结构可以诱导干细胞长入，有助于干细胞的生长、增殖[4]。RADA-16成胶过程中可以加入BMP-2，成胶后将形成特殊的纳米网状结构将BMP-2分子网在胶体内。随着胶体的分解吸收，胶体内的BMP-2逐渐被释放出来，达到缓释成骨诱导因子的作用。本课题使用RADA-16纳米自组装多肽作为BMP-2的载体，既获得了良好的可塑形性，又获得了良好的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器

新西兰大白兔10只，6月龄，雌雄各半，体质量3 kg左右，购自南昌大学附属医院实验动物中心；RADA-16(氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADA-CONH2)，纯度大于90%，购自上海生物工程有限公司；兔淋巴细胞分离液、链霉素、PBS缓冲液和青霉素购自上海阿拉丁试剂有限公司；胰蛋白酶和L-DMEM培养基购自美国PE公司；EM-30Plus扫描电镜购自库赛姆中国，IX71倒置荧光显微镜和IME-II倒置相差显微镜日本Olympus公司。

1.2 多肽的溶解

把10 g蔗糖溶于90 mL去离子水中，完全溶解后分装到2个离心管中，各50 mL。分别取蔗糖溶液1 mL与RADA-16粉10 mg溶于2 mL微型管中，在37 ℃恒温下悬浮超声30 min。

1.3 多肽的自组装

在2 mL微型管中，加入500 μL RADA-16溶液和500 μL的DMEM/F12培养基，用移液管枪头轻轻吹打混合。使RADA-16溶液得最终浓度为0.5%。在37 ℃温箱中孵育30 min后倒置，并观察多肽自组装的情况。

1.4 珊瑚微结构的观察

样本镀金处理，通过50～100倍扫描电镜(冷场)扫描高压蒸汽灭菌后的珊瑚块，采用图像分析软件(Topomatrix)对扫描电镜检测结果进行分析。

1.5 RADA-16-珊瑚超微结构检测

超声处理制备完成的RADA-16溶液20 min，之后把超声后RADA-16溶液浸没珊瑚中，并加入相同体积的细胞DMEM/F12培养基，脱水至黏样粉末状，之后对粉末样本进行镀金处理，通过100～1 000倍扫描电镜(冷场)检测，Topomatrix图像分析软件进行分析。

1.6 RADA-16-珊瑚-BMP-2复合材料超微结构观察

将同体积的RADA-16与BMP-2溶液混合后浸没于珊瑚小块中，同样加入DMEM/F12培养基触发自组装的发生。脱水至黏样粉末状，之后对粉末样本进行镀金处理，通过10 000倍扫描电镜(冷场)检测，Topomatrix图像分析软件进行分析。

1.7 RADKPS 细胞相容性实验

1.7.1 兔BMSCs分离培养 用0.5 mL氯胺酮通过肌肉注射麻醉新西兰大白兔后，抽取约3 mL胫骨下方穿刺的骨髓，迅速加入到15 mL离心管中，并立即加入2 mL肝素钠，混匀摇晃，对兔BMSCs进行分离培养，2 000 r/min离心20 min后，吸取单个骨髓核细胞，PBS洗涤2遍后进行离心计数，并用5 mL的L-DMEM培养液重悬细胞，按1×106个/cm2密度接种于培养瓶中，在湿度培养箱中行原代培养，每48 h换液，3次PBS冲洗后，弃去未贴壁的细胞，之后每2天换液1次，进行传代培养。利用倒置相差显微镜下观察BMSCs细胞形态。

1.7.2 BMSCs细胞活性染色观察 取第3代BMSCs细胞，在0.25%胰蛋白酶消化后，配置浓度为1×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板培养(100 μL/孔)；培养24 h后，分为3组，第1组加100 μL RADA-16/珊瑚/BMP-2溶液，命名为实验组1，第2组加RADA-16/珊瑚溶液，命名为实验组2，第3组加珊瑚溶液，命名为对照组，置于FDA/PI避光培养；在37 ℃下孵育5 min后，用PBS每隔3 min冲洗1次，冲洗3次后，利用倒置荧光显微镜下进行观察。

2 结果

2.1 多肽自组装形成凝胶多肽

RADA-16溶解后形成无色透明水凝胶，微形管倒置30 min后凝胶仍紧密黏附于管底，无滑脱(图1)。

a:形成无色透明水凝胶;b:凝胶黏于管底

2.2 珊瑚微结构的观察

珊瑚于电镜下呈多孔状结构，孔隙排布紧密，大小均匀，孔隙大小从200 μm到500 μm不等(图2a)。130倍扫描电镜下观察，RADA-16自组装多肽凝胶均匀附着于珊瑚孔隙中(图2b)。扫描电镜图像显示在珊瑚空隙中多肽RADA-16自组装形成纳米纤维及片层堆叠结构，其直径从几微米到几十微米不等(图2c)。

2.3 扫描电镜图像显示

自组装多肽的纳米结构分布于珊瑚的空隙中，而在自组装多肽的纳米架构上，均匀黏附着骨形态发生蛋白颗粒。由此，珊瑚、自组装多肽、骨形态发生蛋白三者形成了层层递进的超微复合材料体系(图2d)。

a:50倍电镜下扫描;b:130倍电镜下扫描;c:1000倍扫描电镜下观，珊瑚孔隙中RADA-16自组装多肽凝胶形成规则纳米纤维及片层结构;d:10 000倍扫描电镜下观察骨BMP-2均匀附着于RADA-16自组装多肽凝胶上

图2珊瑚电镜扫描图像

2.4 细胞相容性实验

倒置相差显微镜观察示，第3代新西兰大白兔BMSCs呈长梭形，漩涡样生长。培养3 d后，BMSCs和不同系统的细胞相容性显示，生存细胞发绿色荧光，死亡细胞发红色荧光。BMSCs培养过程中，实验组1、实验组2与对照组内BMSCs未见明显死亡细胞(图3)。

3 讨论

种子细胞、生物材料和调控因子这三种主要的基本元素组合在一起组成了组织工程，体外模拟组织再生发现这三者的组合能够达到修复组织损伤与退变的功能。而在这三要素中，具有良好生物学活性结构的材料少之又少。以往的使用中，用到如壳聚糖、藻酸盐等材料，这些材料远远达不到人天然骨组织的性能，因此构建出具有提供合适的微环境给种子细胞增殖分化且具有优良生物学活性的生物材料成了目前的研究热点[5-6]，其中，自组装多肽纳米纤维凝胶尤其被关注[7]。刘龙刚等[8]制备并评价载有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS的生物相容性，为其在退变髓核再生领域中的体内研究提供实验依据。这是由于肽种的氨基酸之间的众多相互作用使其自身拥有复杂的自组装纳米结构。氨基酸间的相互作用类型的主要包括疏水相互作用，静电、氢键相互作用，范德华力以及芳族相互作用(π-π堆叠)[9]，因此可以利用这些氨基酸间的相互作用的特性影响肽的自组装行为，使其生物材料功能性发挥出来，成为自组装多肽纳米纤维凝胶[10-11]。有研究发现，由于其规则排列形成的三维超微结构，自组装多肽纳米纤维凝胶更接近于天然结构的材料性能，而且还具备原来多肽分子的生物性能[12]。

a:BMSCs细胞形态;b:对照组(珊瑚组)；c:实验组1(RADA-16/珊瑚/BMP-2组)；d:实验组2(RADA-16/珊瑚组)

图3培养3d后，BMSCs和不同系统的细胞相容性

羟基磷灰石是珊瑚的主要成分，这与骨组织的刚性组成成分较相似，且对种子细胞或者活性成分都具有很好的容纳性质，这是由于珊瑚拥有具有较高孔隙率的孔隙结构。RADA-16是一种含水量很高的自组装多肽(含水量99%以上)，其实由阴性氨基酸(A,天门冬氨酸)和阳性氨基酸(R,精氨酸)分别交替组成的，其具有良好的生物相容性[13-15]，可在适宜条件下自发地发生分子间自组装，形成有序三维纤维凝胶支架[16-17]，因此被认为是一种理想的组织工程生物支架材料，已被广泛应用于细胞三维培养、药物缓释及组织再生中。在本实验中选用RADA-16作为凝胶组分的柔性部分，能够更好地在珊瑚刚性结构的保护下，在珊瑚的孔隙中自发形成三维结构，这更有助于为种子细胞的生长提供更适宜的微环境，且进一步增加珊瑚孔隙的表面积。研究表明，人体内骨髓间充质干细胞能够在BMP-2诱导下形成骨细胞分化，这一现象也在体外实验中被证实了，因此整个系统中，BMP-2的加入在微环境中作为生长因子起到重要职能[18]。本文发现RADA-16自组装能够形成凝胶，珊瑚50倍电镜下观察是呈多孔状结构，大小均匀，孔隙在200～500 μm范围内，且孔隙紧密排布，130倍扫描电镜下观察，RADA-16自组装多肽凝胶均匀附着于珊瑚孔隙中，1 000倍扫描电镜显示RADA-16自组装形成片层与网状结构，其直径从几微米到几十微米不等，10 000扫描电镜显示在珊瑚孔隙中，BMP-2黏附于RADA-16，成功合成复合材料体系(RADA-16、珊瑚、BMP-2)。这与陈辰[19]得到的复合材料体超微结构具有高度的相似度，陈辰是利用合成含有连接蛋白核心序列Link N的多肽两亲性分子RADA-16，研究其自组装形成凝胶支架的超微结构，将RADA-16、珊瑚和BMP-2组成复合材料体，并对复合材料体的超微结构进行研究，但并未对其细胞相容性进行研究。

通过BMSCs分离培养观察到该新型功能化RADA-16自组装多肽的合成表征及负载BMP-2对BMSCs细胞无毒性反应，这与刘纪恩等[20]的研究成果一致，其通过合成RADA-16-骨形态发生蛋白(BMP)-2相关多肽(P24)表面修饰活性多肽并在体外诱发其进行自组装,共价修饰聚乳酸羟基乙酸(PLGA)结合成RADA-16-P24-PLGA共聚物，检测与骨BMSCs细胞的毒性反应，发现无毒性反应，这意味着装载有BMP-2功能片段RADA-16/珊瑚纳米水凝胶具有良好的细胞相容性，为进一步动物实验验证其修复骨损失的作用奠定了实验基础。