培养环境条件对花魔芋花粉萌发的影响

覃剑锋，段龙飞，蔡阳光，郭邦利，陈国爱，刘次鹏

(陕西省安康市农业科学研究所，陕西 安康 725021)

魔芋属天南星科 (Araceae) 魔芋属 (AmorphophallusBlume)多年生草本植物，是一种富含葡甘聚糖且应用价值较高的作物。主要分布在亚洲、非洲地区[1]，我国也是其原产国之一，多分布于南方各省山地丘陵区[2]。目前，魔芋育种工作相对滞后，缺少高产、优质、抗病的新品种[3]。杂交育种是培育魔芋新品种的有效途径，但魔芋雌雄同株不同花造成的生殖隔离和魔芋种间花期相差较远造成的时间隔离一直是制约魔芋杂交育种工作的瓶颈[4]。近年来，已基本完成通过温湿度调控魔芋花期以克服时间隔离的研究。但天然授粉成功率低、花粉材料浪费严重，故采用人工辅助授粉显得尤为必要。魔芋花粉包含本属植物的各种基因类型，是种质保存和交换的重要材料[5]。花粉萌发的情况直接决定了杂交育种工作的成败，花粉萌发的情况通常受花粉本身活力、萌发条件等影响[6]。本试验以花魔芋花粉为研究材料，研究不同培养环境条件对其花粉萌发的影响，以期为魔芋杂交育种工作中的人工辅助授粉提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为安康地区重要的栽培农家品种岚皋花魔芋 (A.konjac)，定植于安康市农业科学研究所魔芋种质资源圃。2017年5月8日下午5时切取第2天要散粉植株的雄花序，放在硫酸纸上，第2天收集散出的成熟花粉。

1.2 花粉培养法

采用离体培养法，选用0.7%琼脂固体培养基。溶化后取5 mL液态培养基加入直径90 mm培养皿中，待培养基凝固。花粉用适量无菌水稀释并充分混匀，滴管滴取花粉悬浮液于培养皿中，并用涂布器涂抹均匀。盖好培养皿，置于培养箱中(28 ± 0.2) ℃下暗培养。

选用Olympus CX-22，10×10倍显微镜下观察统计。以花粉管长度超过花粉粒直径的一半以上作为花粉萌发的标准，用明美显微数码测量分析系统进行花粉管长度测量。每个处理每次观察随机取6个视野计数(注：每个视野花粉不少于30粒)，重复3次，计算平均萌发率。利用Excel和SPSS 19.0进行试验数据分析。

花粉萌发率 /%=(萌发的花粉粒数/花粉粒总数)× 100

1.3 试验处理

1.3.1 最适培养基筛选

以花魔芋花粉为供试材料，采用离体萌发法进行最佳培养基筛选试验[7]。设定最适培养基组分[8](蔗糖、硼酸、Ca(NO3)2、MgSO4、KNO3)及各组分含量，利用SPSS软件设计5因子4水平的正交实验方案(表1)。以李勇军报道的[9]魔芋花粉离体培养配方：蔗糖10%、硼酸200 mg·L-1、Ca(NO3)2300 mg·L-1、MgSO4200 mg·L-1、KNO3100 mg·L-1为对照。培养基pH值设定为6.5，在28 ℃的环境下培养4 h后，检测花粉的萌发率以及花粉管长度，根据统计结果确定最佳培养基组分，并利用相关矩阵分析不同培养基组分对花魔芋花粉萌发率和花粉管长度的影响。

1.3.2 最适培养温度筛选

以花魔芋花粉为供试材料，基本培养基选用1.3.1中筛选出的最适培养基(表1编号5培养基)，培养基pH值设定为6.5，在此基础上设置培养温度(4、10、16、22、28、34、40 ℃)进行培养，4 h后取出培养皿分别检测花粉萌发率及花粉管长度。

1.3.3 最适培养时间测定

以花魔芋花粉为供试材料，基本培养基选用1.3.1中筛选出的最适培养基(表1编号5培养基)，培养环境温度设定为28 ℃，培养基pH值设定为6.5，在此基础上设置培养时间(0.5、2.0、4.0、12.0、24.0、48.0 h)进行培养，在不同的培养时间取出培养皿分别统计当前的花粉萌发率及花粉管长度。在统计过程中，随着观察时间的延长，已萌发的花魔芋花粉管逐渐出现破裂解离的现象，影响试验记录的延续性。故在本试验中，前一时间段里已萌发或萌发且花粉管破裂解离的花粉细胞不计在当前的花粉萌发数内。

1.3.4 最适培养pH值测定

以花魔芋花粉为供试材料，基本培养基选用1.3.1中筛选出的最适培养基(表1编号5培养基)，培养环境温度设定为28 ℃，在此基础上设置培养pH值(4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)分别进行培养，4 h后取出培养皿分别检测花粉萌发率及花粉管长度。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对花魔芋花粉萌发和花粉管伸长的影响

结果表明：花魔芋花粉在16号培养基上萌发率最低，在1、5、6、9号和CK培养基上均能较好的萌发，萌发率达到19.00%以上(表1)。其中在5号培养基上花魔芋花粉萌发率最高为28.95%，CK次之，萌发率为26.24%。且5号和CK较其他几种处理差异极显著。从花粉管长度来看，在5号培养基上效果最佳，花粉管长度达到205.34 μm，与其他几种处理差异极显著。故5号培养基(组分为蔗糖10%、H3BO3100 mg·L-1、Ca(NO3)2200 mg·L-1、MgSO4300 mg·L-1、KNO3200 mg·L-1)最适宜于做花魔芋花粉的萌发和花粉管生长研究。

由表2相关矩阵分析可见，不同培养基组分对花魔芋花粉萌发率和花粉管长度的影响不同。对于花魔芋花粉萌发率而言，影响程度依次是硼酸浓度>蔗糖浓度>KNO3浓度>Ca(NO3)2浓度>MgSO4浓度。对于花魔芋花粉管长度而言，影响程度依次是硼酸浓度>KNO3浓度>Ca(NO3)2浓度>MgSO4浓度>蔗糖浓度。

表1 不同培养基对花魔芋花粉萌发率和花粉管长度的影响Table 1 Effect of different culture medium on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac.

注：表中各字母表示不同处理间在0.01极显著水平上差异显著，花粉萌发率之间的差异性用大写字母表示，花粉管长度之间的差异性用小写字母表示。

Note： The differences in germination rate of pollen were expressed in capital letters and in length of pollen tube in lowercase letters.

表2 相关矩阵分析Table 2 Related Matrix analysis

2.2 温度对花魔芋花粉萌发和花粉管伸长的影响

由图1可见，花魔芋花粉的萌发率随着培养温度的升高呈现先升高后降低的趋势，当培养温度为28 ℃时花粉萌发率为27.50%，达到最大值。温度超过34 ℃，萌发率又迅速下降。28 ℃时的萌发率较 22 ℃和34 ℃而言差异不显著，但较其他4个处理差异极显著。在4 ℃和40 ℃时，花魔芋花粉萌发均较低，说明该温度分别接近花魔芋花粉萌发的极限低温和极限高温。就花粉管长度而言，培养温度为28 ℃时达到最大值为251.78 μm，较其它温度下的花粉管长度差异极显著。温度为4 ℃和40 ℃时，仅有零星花粉管生长，且平均长度分别为38.27 μm和 40.12 μm，仅为28 ℃时的15%左右。

试验表明：培养温度过高或过低均不利于花魔芋花粉的萌发及花粉管的伸长。花魔芋花粉仅在22～28 ℃范围内较好的萌发和生长，其中28 ℃是其离体培养的最适温度。

图1 不同温度对花魔芋花粉活萌发率和花粉管长度的影响Fig.1 Effect of different culture temperature on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac 注：图中各字母表示不同处理间在0.01极显著水平上差异显著，花粉萌发率之间的差异性用大写字母表示，花粉管长度之间的差异性用小写字母表示。下同。 Note: The differences in germination rate of pollen were expressed in capital letters and in length of pollen tube in lowercase letters.The same below.

2.3 培养时间对花粉萌发和花粉管伸长的影响

魔芋花粉接种后，在(28 ± 0.2) ℃条件下暗培养，定时测定当前花粉的萌发率和花粉管长度。由图2可见，随着培养时间的延长花粉的即时萌发率呈现先升高后降低的趋势。培养4 h时，花粉即时萌发率达到最大值为27.20%，较其它几种处理差异极显著。随着观察时间的延长，花粉即时萌发率显著降低。表明4 h时，花魔芋花粉集中萌发，为花魔芋花粉萌发率最佳观察时间。

图2 不同培养时间对花魔芋花粉活萌发率和花粉管长度的影响Fig.2 Effect of different culture time on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac

花魔芋即时花粉管长度受不同培养时间影响，在培养0.5～4 h时间范围内，即时花粉管长度随着培养时间的延长而增长。培养4 h时，即时花粉管长度达最大值，为263.36 μm。较其他时间段而言，差异极显著。在培养4～24 h时间范围内，即时花粉管长度呈现急剧下降趋势。在24～48 h内，即时花粉管长度变化平缓。基于培养后即时花粉萌发率和即时花粉管长度的表现趋势，故4 h为花魔芋花粉离体培养观察统计的最适时间。

2.4 培养基pH值对花粉萌发和花粉管伸长的影响

由图3可见，花魔芋花粉萌发率随着pH值的增大呈现出先升高后降低的趋势。在培养基pH值6.0和6.5时花粉萌发率分别为17.09%和17.24%，与其它几种处理相比，达到了极显著差异水平。pH值4.0～6.0时花粉管长度没有明显变化，pH值6.5时，花粉管长度明显上升，且达到最大值，为114.45 μm，较其它几种处理差异极显著。当pH值高于6.5之后，花粉管长度随着pH值的增大而降低。即花魔芋花粉萌发和花粉管伸长的最适pH值为6.5。

3 讨论与结论

目前关于魔芋花粉保存及萌发的研究相对较少，张盛林等[10]、李勇军等[9]研究表明真空干燥低温保存能将魔芋花粉活力维持在一个来年可利用的范围内。张玉进[11]等研究表明魔芋花粉经液氮超低温 (-196 ℃)保存后，较新鲜花粉有更高的离体萌发率。目前，花粉生活力评价主要方法有染色法、离体萌发法及授粉法等[6,7,12]。对魔芋而言，前期的研究主要通过萌发法来检测贮藏魔芋花粉活力[9,11,13]，花粉萌发法测定花粉生活力的确最为直观、准确，但需在25～28 ℃培养3～4 h甚至更长时间，所以李勇军等[14]通过魔芋花粉生活力检测方法的比较研究得出了TTC染色法测定更适用于魔芋花粉活力的快速检测，目前该方法在魔芋花粉活力的检测中应用极广。

图3 不同pH值对花魔芋花粉活萌发率和花粉管长度的影响Fig.3 Effect of different pH values on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac

花粉内壁以及营养细胞的质膜在萌发孔处外突，形成花粉管的乳状顶端的过程称为花粉萌发[15]。有研究表明：硼是影响花粉萌发的重要因素之一[16,17]。离体培养时，在培养基中加入适量的硼和Ca2+有助于花粉的萌发[18,19]。这与本研究结果相一致。一般情况下，一定面积内的人工培养基或柱头上的花粉粒越多，其萌发率就越高，花粉管的生长也越好，这一现象被称之为集体效应。有学者推测花粉的集体效应可能与花粉本身带有激素和营养物质有关。不同植物生长调节物质对花粉萌发和花粉管生长的作用不同。

李勇军等[20]研究了不同培养基组分和培养温度对魔芋花粉萌发和花粉管生长的影响。其研究结果显示，魔芋花粉萌发和花粉管生长的适宜蔗糖浓度为10%～ 15%，适宜培养温度为26～28 ℃，适宜硼酸浓度为150～200 mg·L-1，适宜硝酸钙浓度为200～300 mg·L-1。这与本研究筛选出的最适培养基配方：蔗糖10%、硼酸H3BO3100 mg·L-1、Ca(NO3)2200 mg·L-1、MgSO4300 mg·L-1、KNO3200 mg·L-1略有差异。本研究对离体培养基配方中的每一个组分及其用量均进行了细致研究，从而筛选出最佳组合以应用于实验中。前期研究证实一定浓度的硼酸和硝酸钙可促进魔芋花粉萌发和花粉管生长。硝酸钾在一定浓度范围内对魔芋花粉萌发和花粉管生长影响不显著[20]。本研究通过不同营养组分与花粉萌发率及花粉管长度的相关性分析得出对于花魔芋花粉萌发率而言，影响程度最大的是硼酸浓度，而后依次是蔗糖浓度、KNO3浓度、Ca(NO3)2浓度、MgSO4浓度。对于花魔芋花粉管长度而言，影响程度最大的依然是硼酸浓度，而后依次是KNO3浓度、Ca(NO3)2浓度、MgSO4浓度和蔗糖浓度。

在本试验中，以最重要的魔芋栽培种花魔芋花粉为研究材料，具有很强的代表性。但是离体培养条件研究中，萌发率均不高。这一结果与李勇军等[20]研究结果较为一致。推测花粉整体萌发率不高的原因在于：首先，新鲜采集的花粉本身的萌发率并不高，这可能与散粉时节的气候条件有一定关系。再者，固体培养时如何将花粉均匀散布并保持恒定的培养基表面湿度，可能会影响花粉本身的萌发率。因此，培养方法的改进很有必要。本研究的花粉管长度与李勇军等[20]研究结果存在一定差异，推测主要是因为不同地方种魔芋花粉本身差异较大。