野生金针菇的分子鉴定及遗传多样性分析*

黄龙花，谭武平，刘远超，黄志勇，钟元茂，史 钏，胡惠萍**

（1.广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663）

金针菇隶属于口蘑科（Tricholomataceae）冬菇属（Flammulina），含有丰富的大分子物质，如多糖和糖蛋白，具有提高免疫力、抗癌和抗病毒的功效[1-2]，而且味道鲜美，因此成为重要的食（药）用菌，金针菇已成为工厂化生产的主栽种类。其子实体需要在低温8℃～14℃条件下生长[3]，工厂化生产因降温所产生的能耗成本很高，因此，选育适宜高温生长的金针菇品种，成为金针菇育种的重要研究方向[4-6]。野生金针菇资源的基因型差异为育种提供了丰富的遗传材料，因此研究野生金针菇种质资源的遗传多样性，对今后金针菇育种和菌种知识产权的保护，具有重要的意义。

ITS（internal transcribed spacer）是核糖体DNA上一个非编码区，为中度保守序列，在物种进化过程中，受到的选择压力较小，允许更多的变异，进化速度很快，因而可以提供大量的变异位点和信息位点[7]。ITS不仅在物种鉴定上广泛应用，同时也可以对种内差异进行分析[8]。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

所有供试菌种见表1，11个野生分离种采集自全国各自然保护区，2个市场流通栽培种购自福建某菜市场，13株金针菇菌种都是广东省微生物所食用菌研究发展中心采集或购买并分离纯化的。

1.2 方法

1.2.1 传统形态鉴定

通过肉眼观察标本的菌盖、菌褶、菌柄形态、颜色和附属物。同时用显微镜观察子实体的微观特征：选取待观察的组织，置于5%KOH溶液中观察担子、担孢子、囊状体、盖皮层组织的形态、大小以及颜色反应；参考分类工具书以及新近的研究成果进行形态学分类鉴定[9-14]。

表1 菌种来源及序列登录号Tab.1 Species and their GenBank accession number

1.2.2 PDA 培养基

马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、琼脂15 g，定容至1 L。

1.2.3DNA 提取

将菌丝接种到贴有玻璃纸的PDA培养基上，于25℃培养7 d～10 d后收集新鲜菌丝作为DNA提取材料，使用天根生化科技（北京）有限公司的DP305 DNA提取试剂盒，按说明书操作，得到的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。

1.2.4 PCR 扩增

采用通用引物ITS1和ITS4[15]（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增，引物由Sangon公司合成。Taq酶购自Sangon公司。50 μL反应体系：模板DNA 10 ng～100 ng，ITS1（10 μmol·L-1）2 μL，ITS4（10 μmol·L-1）2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Mg2+（25 mM）3 μL，dNTP（each 10 mmol·L-1）1 μL，Taq DNA Polymerase（5U·μL-1）1 μL，ddH2O补齐到50 μL。扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。1.2.5 克隆测序及序列分析

PCR产物纯化后进行T-A克隆测序，所得序列在NCBI上进行Blast相似性搜索，确定目标序列，根据GenBank中已报道的金针菇ITS序列（Accession No.DQ978220.1） 和“The ITS2 Database”数据库，确定所有金针菇样品的rDNA-ITS序列中ITS1和ITS2与3个编码区18S、5.8S和28S的界限。去除两侧多余序列，只保留ITS1、5.8S和ITS2用于分析。用Clustal W进行序列比对对齐，MEGA Version 6.0进行序列信息位点的统计分析、遗传距离计算和系统发育树的构建，按照Neighbor-joining法，基于Kimura双参数模型，以香菇（Lentinula edodes） 作为外类群，用自展法（Bootstrap，1 000次循环）检验各分支的置信度。

2 结果

2.1 传统形态鉴定

传统形态学分类鉴定可将13个试验菌株分为3个菌种：Flammulina rossica，柳生金针菇，也叫淡色冬菇；Flammulina fennae，国内少见记载，目前尚无通用中文名，在本研究中被李泰辉教授命名为“芬娜金针菇”；Flammulina velutipes，金针菇，也叫冬菇、毛柄金钱菌、朴菰等。

2.2 rDNA ITS序列

经软件处理，所有试验菌株ITS序列信息见表2。13个金针菇样品的ITS序列（只包含ITS1、5.8S rDNA和ITS2） 长度变化范围在698 bp～718 bp，相差20 bp，ITS序列最短的菌株是M140658，最长的是S140014。5.8S rDNA长度为156 bp，高度保守，所有样品只有1个位点的差异，其中E141531、W141696、W141699、N140925在相同位点出现1个AT→CG转换（transition）。

结果显示，ITS1序列长度范围246 bp～250 bp，只相差4 bp，碱基 A占 19.9%，碱基 T占 32.6%，碱基C占25.4%，碱基G占22.1%，各基因型（G+C） 含量差异不大，最低为46.8%，最高为49.6%。当空位（gap）作缺失处理时，ITS1区全序列排序后的长度为261个位点，最长空位（gap） 相差10 bp，共有35个变异位点（variable sites），占总位点的13.4%，22个简约信息位点（parsimony informative sites），占总位点的 8.4%。

表2 实验菌株的ITS序列信息Tab.2 The ITS sequence information of test samples

ITS2序列长度在296 bp～314 bp，相差18个碱基，长度方面ITS1区变化更大，碱基A占16.1%，碱基 T占 31.4%，碱基 C占 26.3%，碱基 G占26.2%，各基因型（G+C） 含量总体高于ITS1区域，变幅为 51.7%～53.2%。当空位 （gap） 作缺失处理时，ITS2区全序列排序后的长度为319个位点，最长空位（gap） 样品M140658相差15 bp，共有27个变异位点，占总位点的8.5%，17个简约信息位点，占总位点的5.0%。

2.3 菌株间遗传距离计算和系统发育树构建

2.3.1 遗传距离

根据Kimura双参数方法计算全国11个野生金针菇和2个栽培金针菇菌株遗传距离，结果见表3。

由表3可知，13个金针菇种间遗传距离在0～0.045，其中Flammulina velutipes种内遗传距离较小（0～0.008），Flammulina rossica 种内遗传距离较大（0.002～0.014）。而黑龙江日月峡的 Flammulina velutipes与黑龙江五营的Flammulina rossica遗传距离最大，为 0.045。

2.3.2 系统发育树

按照Neighbor-joining法，基于Kimura双参数模型，以香菇（Lentinula edodes） 作为外类群，用自展法（Bootstrap，1 000次循环）检验各分支的置信度。将13个金针菇与GenBank上公布的国内外其他金针菇菌株的ITS序列进行比对，分析他们的系统发育关系，结果见图1。从图1可知，所有试验菌株可以分为3个不同的种：柳生金针菇（Flammulina rossica）、芬娜金针菇（Flammulina fennae）、金针菇（Flammulina velutipes）。Flammulina velutipes以 98%的可信度聚在一起形成一个分支，这一分支与Flammulina rossica和Flammulina fennae组成的单系分支构成姐妹群，其中Flammulina rossica以99%的可信度聚成1个分支，而2个Flammulina fennae以90%的可信度聚成1个分支。

表3 13株金针菇ITS序列的遗传距离矩阵Tab.3 The genetic distance matrix of ITS sequences of thirteen Flammulina sp.

野生金针菇的地域差异，在系统发育树中同样得到很好的支持。黑龙江采集的E141531、W141696、W141699以81%的可信度聚在一起；四川省采集的E141870、N140864和N140951以87%的可信度聚在一起；湖南莽山的S140014菌株与广东南岭的N140982菌株以84%的可信度聚在一起，说明亲缘关系很近，遗传距离为0.002，这是因为湖南莽山和广东南岭本就是同一山脉，只因被省界隔开而出现不同名称；另外，内蒙古采集的M140658单独构成1个分支。系统发育树表现出金针菇的种属差异和地域差异，说明ITS1-5.8S-ITS2 rDNA可以用于鉴别金针菇的遗传关系。

3 讨论

图1 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequences

在系统学分析中，ITS1或ITS2的序列可作为单独的片段进行系统发育分析[16]，但是更多的研究者是将2个片段综合考虑[17-19]。

本研究中13个金针菇样品，ITS1-5.8S-ITS2片段长度均在710 bp左右，ITS1和ITS2序列的变异位点数分别为35个和27个，占总位点的13.4%和8.5%，且ITS1序列的简约信息位点也多于ITS2序列，分别占总位点的8.4%和5.0%，这表明金针菇ITS1序列变异明显大于ITS2序列。因此，如果采用单个区间分别对不同金针菇种进行系统发育分析，选择ITS1序列更适合。不同物种间可能存在差异，王化坤[20]的研究发现桃、李、樱桃的ITS1序列变异位点高于ITS2序列，而梅的ITS1序列变异位点低于ITS2序列。本研究中，采集到的菌株种类和采集地域有限，在扩大采样群体后，菌株的信息位点和变异位点都有可能增加。

通过构建系统发育树，种属差异和地域差异都得到了很好的体现。四川的Flammulina rossica样品与黑龙江的Flammulina rossica样品分别聚在2个小分支，四川的样品采集地均在海拔3 000 m以上，采集时平均温度在8℃左右，而黑龙江的样品采集时平均气温为20℃左右，有望开发成耐高温金针菇品种。内蒙古采集的Flammulina fennae单独聚在1个分支，目前尚无中文名，因似少女的纤细体型，由李泰辉教授命名为“芬娜金针菇”，经驯化发现，该株金针菇出菇温度较高，商品性状好（菌柄细长笔直、长度均匀；菌盖小而均匀；菌柄基部不粘黏），具有较好的开发利用价值。野生菌种的遗传多样性为金针菇的优良新菌种选育提供了丰富种质资源。

4 结论

通过对采自全国7个自然保护区共计11个野生金针菇和2个常见栽培金针菇菌株，进行ITS-PCR和产物测序。基于ITS序列进行菌株的遗传距离分析和系统发育分析，结果显示，金针菇的ITS1序列比ITS2序列进化速率快，变异位点和简约信息位点差异较大；13株金针菇种内遗传距离为0～0.014，种间遗传距离为 0.029～0.045；ITS 系统发育树支持将13个菌株分为3个类群，且相同菌种地域越近则亲缘关系也越近。