东莞市H1N1亚型猪流感抗体血清学调查

陈盛文，潘 杰，陈丽萍，柳小强，王自强，张险朋★

（1.广东省东莞市长安镇农业技术服务中心，广东 东莞 523846；2.东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

猪流感（Swine influenza，SI）是由猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起猪的急性呼吸道传染病，是一种人畜共患传染病。猪流感病毒属于正黏病毒科，A型流感病毒属。猪群中流行的猪流感毒株主要是经典型H1N1、类人型H3N2、类禽型 H1N1，另外 H1N2、H1N7、H3N6 等亚型的毒株也有报道。目前，世界广泛流行的猪流感血清型主要是H1N1、H1N2和H3N2，其中，猪群中H1N1亚型猪流感流行最为普遍，全球有25%的猪群受到过H1N1亚型猪流感病毒的感染。猪感染猪流感病毒以后主要的临床特征是突发、高热、咳嗽、呼吸困难、高发病率、低死亡率。猪流感在单独感染的情况下，死亡率很低，如果是继发或混合感染其他呼吸道细菌、病毒感染可以使猪的病情加重，死亡率增加，从而引起养猪业的重大经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将猪流感列为法定报告动物疫病，我国将其列为三类动物疫病。1918年首先在美国报告了猪流感的疫情，随后世界各大洲均有本病的发生和流行。2009年3月，墨西哥发生了人感染H1N1亚型猪流感疫情，并很快传入多个国家，刚开始世界卫生组织（WHO）称为人感染猪流感，后来我国将其更名为“甲型H1N1流感”。由于猪是猪流感、禽流感和人流感病毒的“混合器”，猪流感也可以传染给人，在A型流感的流行、传播和病毒遗传变异中起到很特殊的作用，因此猪流感在公共卫生中具有很重要的意义。为了掌握H1N1亚型猪流感在东莞市的流行情况，在2015～2017年在东莞市猪养殖场采集猪血清进行调查，现将调查结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 被检血清 2015～2017年采自东莞市猪养殖场，共937份。采用猪前腔静脉采血，3000r/min,分离出血清，-20℃保存，备检。

1.1.2 试剂 H1N1亚型猪流感抗体ELISA试剂盒，购自加拿大Biovet公司。

1.1.3 仪器设备 Sunrise酶标仪购自奥地利Tecan公司，移液器购自eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 用洗涤液1：10稀释待检血清。按照顺序依次加入50μL的阳性、阴性对照血清和稀释的血清，封板，室温（23±2℃）下孵育1h。

1.2.2 弃去孔内所有液体，每孔加入300μL的洗涤液进行泡洗，重复洗板4次，最后一次在吸水纸上拍干孔内液体。

1.2.3 每孔加入50μL工作浓度的单克隆抗体，封板，室温（23±2℃）下孵育15min。弃去孔内所有液体，上述方法洗板。

1.2.4 每孔加入50μL工作浓度的HRP酶标二抗，封板，室温（23±2℃）下孵育1h。弃去孔内所有液体，弃去孔内所有液体，上述方法洗板。

1.2.5 每孔加入100μL的底物显色剂，室温（23±2℃）下避光孵育10min。

1.2.6 每孔加入100μL的终止液，15min内在450nm波长下读取吸光度值。

1.2.7 抑制率的计算：抑制率（%）=[1-(样品OD值÷阴性对照平均值)]×100

1.2.8 结果判定

阴性标准对照血清的OD平均值必须大于0.8，而且阳性标准对照血清的抑制率必须大于85%，试验结果成立。当样品的抑制率大于或者等于30%，判为H1N1亚型猪流感病毒抗体阳性；当样品的抑制率小于30%，判为H1N1亚型猪流感病毒抗体阴性。

2 结果

2015～2017年共检测猪养殖场点个次68个，937份猪血清，抗体阳性数411份，抗体阳性率为43.86%，其中2015～2017年的抗体阳性率分别为 62.83%、57.08%、26.06%，详细结果见表1。年度抗体阳性率，有显著的差异，从2015～2017年，H1N1亚型猪流感病毒抗体有下降的趋势，趋势图（见图1）。

表1 2015-2017年东莞市H1N1亚型猪流感病毒抗体检测结果

图1 2015～2017年东莞市H1N1猪流感抗体阳性率趋势图

3 讨论

根据试验结果，2015～2017年东莞市H1N1亚型猪流感抗体的阳性率为43.86%，由于东莞市猪养殖场的猪群均未免疫猪流感疫苗，所以试验结果表明东莞市的猪群存在H1N1亚型猪流感的感染或曾经感染。陈樱等在2009～2013年对广西11个地级市的猪群进行血清学调查，H1N1亚型猪流感的抗体阳性为20.68%；黄秉政等在2012年2月至2013年5月，对来自山东省规模化猪场进行H1N1亚型猪流感血清学调查，抗体阳性率为33.31%；施蔡培等在2011～2013年对上海崇明地区规模猪场猪流感血清学调查，H1N1亚型猪流感抗体阳性分别为40.13%、40.24%和48.91%。上述地区的调查结果H1N1亚型猪流感的抗体阳性率有所差异，但结果都表明，猪群普遍存在H1N1亚型猪流感病的感染或曾经感染。

猪的上呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6的唾液酸受体分子，其中α-2,3是人流感病毒的受体，α-2,6是禽流感病毒的受体，所以猪是人、猪、禽流感病毒的共同宿主，是不同流感病毒的“混合器”，很多新型的流感病毒都是在猪体内混合产生。所以，做好猪流感的防控不仅在降低畜牧业中经济损失具有很大作用，在公共卫生中也具有很重要的意义。做好猪流感的防控，（1）改善猪场的养殖环境，降低饲养密度，做好猪舍的通风，定期对环境进行消毒，提高猪群的免疫力；（2）生猪进行调运时加强检疫，发现猪群有流感症状，禁止猪群的调运；（3）加强猪流感的公共卫生的宣传，发现猪群有流感症状的发生及时上报，做好监测，同时，饲养员或养殖场人员出现流感症状也禁入猪舍，防止人的流感传给猪；（4）猪养殖场禁止同时饲养家禽，防止禽流感病毒传给猪。

目前，检测猪流感抗体的方法主要是酶联免疫吸附试验和血凝抑制试验，研究表明这两种方法的符合性较高。血凝抑制试验操作比较复杂，试验过程需要去除非特异性的物质，试验时间较长，抗原的效价和结果的判定受人为因素的影响，优点是血凝抑制的检测成本较低，不需要贵重仪器，适合基层的推广。此次试验采用的是酶联免疫吸附试验方法，适合大规模样品的监测，用酶标仪读数，人为主观因素影响小，操作简便，试验时间短，缺点是采用商品化试剂盒，检测的成本较高。

自从2009年暴发甲型H1N1流感以来，猪流感的研究已经得到研究人员的关注，由于猪流感在在猪体内可能会发生重组的现象，出现新型病毒。猪群的流感和人的流感密切相关，人群中流行的甲型H1N1流感，在猪群也能很快的就能检测H1N1亚型猪流感抗体的阳性率大幅上升，猪群中流行的猪流感毒株也可能很快就传给人。试验结果显示，3年来H1N1亚型猪流感抗体是呈下降趋势，根据从卫生部门了解到，这两年来东莞市人流行的甲型流感是以H3N2为主，阳性率下降可能是因为流感流行的优势毒株在转变，猪流感和人流感的相关性还有待进一步的研究。因此，加强猪流感的监测，可以及时发现新型的毒株，为动物流感和人的流感流行做好预警和预测，为猪流感的防控提供可靠的数据。