单味中药对牦牛多杀性巴氏杆菌的体外抑菌试验

李辉明

(青海省同仁县畜牧兽医工作站， 青海 同仁 811399)

牦牛主要分布在海拔3 000～5 000 m的高寒缺氧地区喜马拉雅山脉和青藏高原的特有的乳、肉、役、毛等兼用地方家畜品种，牦牛不仅是牧区主要劳动力，还为生产、生活提供可用资源。多杀性巴氏杆菌是一种两端钝圆、短杆状革兰阴性菌，该菌属于巴氏杆菌科，巴氏杆菌属，该菌具有A、B、D、E和F 5个血清型，多杀亚种、败血亚种及杀禽亚种3个亚种。多杀性巴氏杆菌广泛分布环境中，是重要的人兽共患病细菌，可以引发鸡、牛、羊、猪、鹿、貉子、水貂等多种动物及人发病，对不同动物均有不同的致病性，其中，家畜动物中以牛、水牛、牦牛、羊、马等易感，急性呈出血性败血症症状，感染率和死亡率均较高[1]。牦牛巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌所引起的以内脏器官广泛出血、高热和肺炎为特征的急性败血性传染病，临床上以黏膜和各脏器出血、脾脏和肝脏肿大为主要的特征，慢性病例多在肝脏等局部发生坏死性病灶或炎性病灶，死亡率通常在20%～30%之间，给我国的牦牛养殖业造成巨大的经济损失[2-3]。

目前，牦牛巴氏杆菌病主要通过抗生素进行治疗，在牦牛养殖过程中，由于不合理的使用抗菌药物，对牦牛巴氏杆菌产生很强的耐药性，治疗效果不佳，同时也造成了大量的药物残留[8]。中药富含多种有效抗菌成分，具有无残留、无耐药性等优点，被广泛应用于畜禽疾病防治中[9]。本研究利用平板打孔法和二倍试管稀释法分别测定22味中药对临床分离的牦牛致病性多杀性巴氏杆菌体外抑菌效果，筛选出对牦牛致病性多杀性巴氏杆菌敏感的中药，为牦牛致病性多杀性巴氏杆菌病的防治提供实验基础。

1 材料

1.1 菌株 临床分离的牦牛致病性多杀性巴氏杆菌菌株，由青海省同仁县畜牧兽医工作站疾病检测实验室保存。

1.2 试剂及仪器 五味子、金银花等22味中药，购自同仁县医药大药房；7%动物血平板、营养肉汤培养基，购自北京博奥星生物技术有限责任公司；无支原体犊牛血清，购自山西润生生物材料有限公司；隔水式恒温培养箱(由上海一恒科技仪器有限公司生产)；双人超净工作台(由上海申顺生物科技有限公司生产)；7%绵羊脱纤血平板由高压灭菌锅、天平、烧杯等常规的仪器及试剂由青海省同仁县畜牧兽医工作站疾病检测实验室提供。

2 方法

2.1 单味中药药液的制备 利用水煮法制备22味中药的药液，用干燥箱烘干后，称量50 g，加入8～10倍蒸馏水，浸泡1～2 h后，煮沸后用慢火文煮30 min，12层纱布过滤后，加入5倍的蒸馏水再煮1次，合并2次水煮药液，浓缩原药液浓度为1 g/mL，离心、分装，121 ℃高压灭菌15 min后，4 ℃保存备用。

2.2 试验菌液的制备与计数 将牦牛致病性多杀性巴氏杆菌菌株室温复苏，接种于7%动物血平板，置37 ℃恒温的培养箱中培养12 h，挑取单个菌落接种于含5%犊牛血清营养肉汤， 37 ℃震荡培养12 h，利用平板细菌计数法，对培养好的牦牛致病性多杀性巴氏杆菌进行计数，调整菌液浓度为106CFU/mL。

2.3 中药体外抑菌圈直径的测定 利用平板打孔法测定22味中药体外抑菌圈直径。在无菌的条件下取调整好的菌液0.1 mL(106CFU/mL)均匀涂在7%动物血平板上，用直径6 mm打孔器进行打孔，每孔内加满中药液体，对照孔加入等量营养肉汤，每种药物重复3次。置于37 ℃恒温培养箱中培养12～16 h，测量抑菌圈直径，取每种药物重复3次平均值。判定标准为：10 mm<抑菌直径为低敏；10 mm≤抑菌直径<15 mm为中敏；15 mm≤抑菌直径<20 mm为高敏；20 mm≤抑菌直径为极敏[3]。

2.4 中药MBC的测定 利用二倍试管稀释测定MBC[10]，取12只编号的灭菌的试管，每个试管中加入无菌的营养肉汤4 mL，在第1管中加4 mL中药水提物混匀，取出4 mL混合药液放入第2管，取出4 mL放入第3管，依此类推，稀释到第10管，弃去4 mL，第11管为阳性对照，第12管为阴性对照。在1～11只试管中加入菌液40 μL(106CFU/mL)，每一种药物3个重复，混合均匀后，置37 ℃培养18～24 h后，将每个药物不同浓度的培养物接种于普通培养基上，37 ℃培养箱中培养12 h。无细菌生长中药水提物浓度梯度为该药的MBC。

3 结果

中药体外抑菌圈直径测定结果

表1 22味中药抑菌圈直径测定结果 (mm)

-：无敏感性，下表同

由表1可知，牦牛致病性多杀性巴氏杆菌对金银花、黄连、五味子、板蓝根、透骨草、连翘5种药物极度敏感，抑菌圈在16.6 mm～18.7 mm之间；对白头翁、黄芩、五倍子、诃子、酱败草、大黄、防风、紫花地丁8种药物中度敏感；对秦皮、蒲公英2种药物低敏；对其他药物无敏感性。

表2 22味中药MBC测定结果 (mg/mL)

由表2可知，牦牛致病性多杀性巴氏杆菌对金银花、黄连、五味子、板蓝根、透骨草、连翘5种药物MBC最小，MBC在7.8 mg/mL～15.63 mg/mL之间；对白头翁、黄芩、诃子、五倍子、酱败草、大黄、防风、紫花地丁8种药物的MBC在62.5 mg/mL ～125 mg/mL之间；黄芩、秦皮、蒲公英3种药物的MBC在250 mg/mL～500 mg/mL，对其他药物无敏感性。

4 讨论

牦牛是分布于海拔3 000～5 000 m的高寒缺氧地区特有的乳、肉、役、毛等兼用地方家畜品种，为青海地区主要养殖动物。近几年，关于牦牛的多杀性巴氏杆菌病报道越来越多[3]。

因此，多杀性巴氏杆菌病成为了牦牛养殖过程中常见的传染性疾病。多杀性巴氏杆菌广泛存在环境中，传播途径广泛，是重要的条件致病菌，可以引发多种动物发病。当外界条件发生改变时，天气突变、昼夜温差大，转群、动物的长途运输等多种应激反应等，均会导致动物机体的抵抗力降低，引发动物的多杀性巴氏杆菌病。当动物感染了多杀性巴氏杆菌后，通过咳嗽、喷嚏排出的病原菌引起其他动物发病，因此，该病不容易被控制。多杀性巴氏杆菌疫苗虽然已有研制，在兔的养殖过程中被广泛应用，但是在牦牛没有完全应用。

可能由于地域和血清型的差异[4]。牦牛巴氏杆菌主要利用抗生素治疗，但是抗生素易产生很强的耐药性，降低了治疗效果，同时也造成牦牛肉等畜产品中大量的药物残留。因此，利用中药防治牦牛巴氏杆菌成为新的研究方向。

本试验测定22味中药对牦牛致病性多杀性巴氏杆菌体外抑菌试验，结果显示，牦牛致病性多杀性巴氏杆菌对金银花、黄连、五味子、板蓝根、透骨草、连翘5种药物极度敏感，抑菌圈直径在16.6 mm～18.7 mm之间，MBC在7.8 mg/mL～15.63 mg/mL之间。对其他药物存在不同程度的敏感性。常超越等[3]报道了对五倍子、白头翁、黄芩等9种药物对鸡源致病性多杀性巴氏杆菌高敏。曲径等[5]研究表明了黄连、黄柏、地榆、艾叶4种药物对禽多杀性巴氏杆菌敏感。中药富含多种活性的化学抗菌物质，但是中药的抗菌机理尚未研究明确，有待进一步研究中药的抗菌机理。本研究为进一步研发复方中药制剂防治牦牛致病性多杀性巴氏杆菌病提供理论基础。