鹿结核自然病例结核分枝杆菌复合物的鉴定与分型

2018-08-01任永鑫王卫红

中国兽医杂志 2018年4期

任永鑫,王卫红,孙斌

(1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319 ；2. 吉林省吉林市动物疾病预防控制中心，吉林吉林 132013)

结核病是由牛分歧杆菌和结核分歧杆菌引起的一种慢性传染性人兽共患病，在世界范围内均有发生，为畜牧业和人类健康都带来的长期而隐性的威胁。牛分枝杆菌和人型结核分枝杆菌都是人类结核病的主要病原，病鹿尤其是开放性结核病鹿是人类结核病的主要传染源之一。因此，本试验对收集的当地鹿场5例鹿结核自然病例进行结核分枝杆菌复合物分子生物学鉴定和基因分型，为动物结核病的防控提供临床数据。

1 材料与方法

1.1 材料鹿结核病料来自本校病理室保存的鹿结核固定标本2例(1984年以前，脾结核和肺结核)，黑龙江省大庆市某鹿场送检梅花鹿(3岁)结核病1例(2004年6月，粟粒性肺结核)，大兴安岭某林业局送检驯鹿结核病1例(2010年，PPD阳性，肺结核)，黑龙江省七台河市某鹿场结核病梅花鹿1例(2011年，PPD阳性，肺结核)，共计5例。

1.2 仪器设备 PCR仪(宝生物工程(大连)有限公司)；电泳仪(美国Bio-Ran Model 200/2.0)、GeneGenius凝胶成像系统(英国SynGene公司)；微量电子天平(METTER AE260型，Deltalange公司)；pH计(EUTECH CyberScan Ph/Ion 510)、高速冷冻离心机(德国Backman J2-21M)。组织自动脱水机(Leica)、组织自动染色机(国产)；组织切片机。

1.3 试剂 10 mmol/L Tris·HCl pH值7.4，10 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，10%SDS，蛋白酶K(20 mg/mL或粉剂)，酚，氯仿，无水乙醇及70%乙醇，5 mol/L NaCl，3 mol/L NaAc，TE，PFU DNA聚合酶(MBI公司产品);100 bp ladder 和2 000 bp DNA Marker(TaKaRa公司产品)，EDTA(0.5 mol/L，pH值8.0)。50 X TAE电泳缓冲液(贮存液)，5 mol/L NaCl，10% SDS，10 mg/mL溴化乙锭(EB)，1%琼脂糖凝。组织切片制作试剂。

1.4 病理组织切片制作按《病理组织制片和染色技术》[1]所述常规病理组织学方法取材、固定、水洗、脱水、切片染色，光学显微镜下观察。

1.5 提取结核杆菌DNA[2]切取病灶组织5 g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)。倒入液氮，磨成粉末，加10 mL分离缓冲液。加1 mL 10% SDS，混匀，此时样品变得很黏稠。加50 uL或1 mg蛋白酶K，50 ℃水浴2 h或37 ℃水浴过夜，直到组织完全解体。加1 mL 5 mol/L NaCl，混匀，5 000 r/min离心10 min。取上清液于新离心管，用等体积酚：氯仿抽提。待分层后，8 000 r/min离心10 min。取上层水相至干净离心管，加等体积氯仿抽提。取上层水相至干净离心管。加1/10体积3 mol/L CH3COONa，及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10～20 min，DNA沉淀形成白色絮状物。用玻棒钩出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，晾干或置于超净台吹干，溶解于1 mL TE(含RNA酶)中，-20 ℃保存。如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5 000 r/min短暂离心，取上清。

1.6 结核分枝杆菌复合物的鉴定和分型以IS6110插入序列设计引物进行结核分枝杆菌复合物的鉴定[3]。根据GenBank中发表的结核分枝杆菌复合物IS6110插入序列(检索号X17348)，应用Oligo(7.0)设计特异性引物，引物由上海Sangon公司合成。用ddH2O按10 pmol/μL稀释，-20 ℃保存备用。

根据Bakshi C S等报道的单管多重PCR方法[4]，对所分离的结核分枝杆菌复合物PCR鉴定阳性DNA提取物进行牛分枝杆菌和结核分枝杆菌菌种鉴定。

表1 IS6110鉴定结核分枝杆菌和复合物引物序列

表2 结核分枝杆菌和复合物分型引物序列

2 试验结果

2.1 病理学观察送检的3头病鹿都消瘦，剖检可见肺部有弥散性分布的病灶，大小不等，粟粒大至鹌鹑蛋大。小病灶白色或灰白色，结节状。大的病灶灰黄白色，乳酪状。病灶切面干酪样，与周边肺组织分界明显。纵膈淋巴结有陈旧性出血。镜下观察，肺结核灶中心凝固坏死呈现匀质红染，明显的有上皮样细胞和朗罕氏细胞，边缘有大量淋巴细胞浸润。病灶周围水肿、出血、嗜中性粒细胞浸润。见中插彩版图1、2。

2.2 结核分枝杆菌复合物的鉴定和分型 5份病料提取的DNA经插入序列IS6110 DNA聚合酶链反应(PCR)鉴定，均为结核分枝杆菌复合物，如图3所示，特异性条带在340 bp左右，与预期设计片段大小相一致。

图3 采用IS6110-PCR进行结核杆菌复合物鉴定结果

1、2、3、4、5分别为样品， C：阴性对照，M：2 000 bp Marker，特异性条带在340 bp左右

用Bakshi C S等报道的单管多重PCR法对5份结核分枝杆菌复合物DNA进行牛分枝杆菌和结核分枝杆菌菌种鉴定结果如图4所示，分别得到两条约500 bp电泳条带(人型结核杆菌，1、3)，3条250 bp条带(牛型结核杆菌2、4和5)。

3 讨论与分析

所采集的鹿结核自然病例其病原2例为人型结核分枝杆菌，3例为牛型结核分枝杆菌。结果表明，鹿结核病的主要病原菌为牛分枝杆菌，但也存在人型结核杆菌，与王春雨等的报道吉林鹿场发病情况相似[5]。因此，结核病在人与其他动物间相互传染得到进一步验证。另外，人工养殖鹿作为观赏、食用、药用等诸多经济用途的经济动物，与人类接触愈发密切，鹿结核人兽共患的特点应该成为检疫部门关注的重点之一。牛、鹿等畜禽与野生动物结核病对人类健康也存在着巨大的潜在威胁，防控畜禽和野生动物结核病对公共卫生安全有至关重要的意义。本试验病例数较少，尚不能说明规律，而分子生物学比对分析还需进行一步做基因多态性分析。