精胺代谢对连作番茄根结线虫病及其土壤微生物的影响

林丽飞， 张 敏， 和 平， 罗巧育， 胡先奇

(1.云南农业大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南昆明 650201；2.云南省农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室/红河学院，云南蒙自 661100)

植物根结线虫病是由根结线虫(Meloidogynespp.)引起的一种世界性病害，寄主超过3 000种，尤以茄科、葫芦科、十字花科等植物受害严重，蔬菜根结线虫病在我国南方、北方都能发生，且呈逐年加重趋势[1]。尤其是南方根结线虫，由于其寄主范围广、致病性强、繁殖速度快、易传播扩散等特性，目前已成为世界各地蔬菜种植区最重要的病原物类群之一[2]。在我国由于温室连作现象较严重，致使许多老龄温室南方根结线虫病害的发生尤为严重，一般每年造成的经济损失为10%～15%，严重者损失可达30%～40%，甚至绝产[3]。土壤线虫、土壤微生物及植物均与连作引起的植物根结线虫病害有关，但关于三者之间相互关系的研究较少，更少见精胺对番茄连作病土与三者关系影响的研究报道。连作病土对连作番茄的危害现象普遍存在，但对连作番茄的危害程度及对土壤微生物与土壤线虫的影响程度缺乏系统研究。

精胺(spermine，简称Spm)是一种内源性物质，广泛存在于生物体内，自20世纪60年代美国耶鲁大学的学者提出多胺具有刺激生长和防止衰老的作用以来，越来越多的研究表明，多胺具有较强延缓植物叶片衰老的作用[4]。它不仅可以直接与活性氧(reactive oxygen species，简称ROS)反应，还可以通过提高抗氧化酶活性参与胁迫条件下ROS的清除，增强植物抗逆性[5]。但有关精胺的研究和报道较少，尤其是其与南方根结线虫的相互作用目前还未见报道。本试验采用温室盆栽人工接种法研究精胺代谢物对连作番茄南方根结线虫病的抗性程度，重点考察精胺处理后的健康土壤及感病土壤对连作番茄根结线虫病发病程度及各种抗氧化酶活性的影响，并对土壤中的微生物数量进行初步研究，以期为深入了解精胺代谢对连作番茄根结线虫病连作障碍发生的微生态机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄种子由云南农业大学植物保护学院王扬老师惠赠，供试土壤于2016年9月采自云南农业大学温室，是上茬经不同浓度精胺处理的番茄根区土壤，经过贝尔曼法测定得到病土中的线虫密度为4 000条/kg，上茬的处理方法是对番茄苗叶面喷施精胺溶液，连续喷雾5 d，第6天开始接种线虫，接种二龄线虫1 000头/株。试验中的精胺溶液设置5个浓度梯度处理，分别用A、B、C、D、N、CK表示，即A：1.0 mmol/L Spm+根结线虫；B：1.5 mmol/L Spm+根结线虫；C：2.0 mmol/L Spm+根结线虫；D：3.0 mmol/L Spm+根结线虫；N：病土对照；CK：健康土壤对照；喷施时间是每天 09：00—10：00。

牛肉膏蛋白胨培养基：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，15.0～25.0 g琼脂，1 000 mL水，pH值为7.4～7.6。

PDA培养基：1 000 mL 20%马铃薯浸出液，10～20 g葡萄糖，17～20 g琼脂。

1.2 试验方法

将番茄种子用70%乙醇消毒30 s，再用5%次氯酸钠溶液消毒2 min，用无菌水清洗3次。将消毒后的种子播于育苗盘中，约1个月后，当番茄苗长出3～4张真叶时，移栽到上茬经过不同浓度Spm处理的番茄根区土壤里，每个处理5次重复。

1.3 连作番茄生理指标的测定

1.3.1 番茄叶片抗氧化酶活性测定 移栽30 d后，取温室中番茄植株的根及叶片，清洗干净，测定番茄生长势，统计根结数量，计算根结指数，计算方法参照文献[6-7]；并测定过氧化物酶(peroxidase，简称POD)活性、过氧化氢酶(catalase，简称CAT)活性、丙二醛(malondialdehyde，简称MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)活性，测定方法参照文献[8-9]。

1.3.2 土壤根际微生物数量的测定及微生物统计 测定方法参照文献[10]，收集5株植株的栽培土壤，混匀后采用四分法取1 kg土壤，装入无菌塑料袋带回实验室，于4 ℃冰箱保存。准确称取10 g待测土壤样品，放入装有90 mL无菌水并放有小玻璃珠的250 mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物分散，静置20～30 s，即可得到10-1稀释液；连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释菌液，然后将稀释菌液涂至盛有培养基的平板上，将涂抹好的平板平放于桌上20～30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒置，于25～28 ℃黑暗培养，至长出菌落后进行计数，测定土壤中细菌、真菌的数量，微生物计数采用传统的方法进行，从接种后的5个稀释度中选择一个合适的稀释度进行计数。选择时注意同一稀释度各个重复的菌数相差不能太悬殊。每皿30～300个细菌菌落为宜；每皿10～100个真菌菌落为宜。如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，真菌采用PDA培养基进行培养。

2 结果与分析

2.1 不同处理水平对连作番茄生理的影响

由表1可知，在南方根结线虫侵染和精胺处理后，番茄的生长会受到抑制，与健康土壤对照相比，株高受到影响。不同浓度的精胺处理对连作番茄根结线虫病有一定的影响，其中1.0 mmol/L精胺处理后，番茄的茎粗最大，为0.73 cm，此时根结数量最少，最大根结直径最小。

表1 不同处理对连作番茄生长势的影响

2.2 不同处理对连作番茄超氧化物歧化酶的影响

由图1可知，与健康土壤对照相比，其他处理的超氧化物歧化酶活性均有所增加，说明喷施精胺能够提高番茄的超氧化物歧化酶活性，且当精胺浓度为1.0 mmol/L时，处理后连作番茄的超氧化物歧化酶浓度增加得最多，能够有效提高番茄对根结线虫病的抗性。这一结果与卢树昌等的研究结果[11]基本一致。

2.3 不同处理对连作番茄过氧化物酶活性的影响

过氧化物酶在植物体内包括组成型表达和诱导表达，其中诱导表达的诱导因子非常广泛，既有生物类激发子(如各类病原物的侵染等)，也有高温、冷冻、干旱、风力、重金属离子、机械损伤等非生物类激发子[12]。由图2可知，根结线虫侵染后，对连作番茄过氧化物酶活性的影响不大，而经过喷施1.0 mmol/L精胺后，番茄的过氧化氢酶活性明显增强。说明在南方根结线虫胁迫下精胺能够提高连作番茄的抗逆性。

2.4 不同处理对连作番茄丙二醛含量的影响

由图3可知，在南方根结线虫侵染后，丙二醛的含量明显增加，不同浓度的精胺处理对番茄丙二醛含量的影响较大，健康土壤对照的番茄丙二醛含量比其他处理组低，其中 1.0 mmol/L 精胺代谢能够明显降低膜脂过氧化程度。说明精胺处理对连作番茄根结线虫病有一定的抑制作用。

2.5 不同处理组对连作番茄过氧化氢酶活性的影响

由图4可知，与健康土壤对照相比，南方根结线虫处理后，番茄的过氧化氢酶活性下降。经过不同浓度的精胺处理后，过氧化氢酶活性变化差异较大，随着精胺浓度的增加，过氧化氢酶活性呈下降趋势，即当精胺浓度为1.0 mmol/L时，过氧化物酶活性最大，为9.25 U/(g·min)，当精胺浓度为 3.0 mmol/L 时，过氧化氢酶活性最低，为1.75 U/(g·min)。这与陈金锋等的研究结果[13]相似。

2.6 不同处理组对土壤细菌数量的影响

土壤生物群落结构的变化可以作为土壤变化的早期预警生态指标[14]。由图5可知，健康土壤对照处理番茄根区土壤中细菌总数是1.78×106CUF/g，A、B处理土壤中的细菌数量较多，分别为3.10×106、2.43×106CFU/g，土壤细菌数量最少的是N处理，为1.46×106CFU/g。可见不同处理对根际土壤中细菌数量的影响不同。A处理土壤中细菌总量最多，其次是B处理，C、D处理的土壤中细菌数量与CK、N处理相差不大。

2.7 不同处理组对土壤真菌数量的影响

由图6可知，经过不同处理后番茄根际土壤真菌数量的变化趋势与细菌不同。CK处理的土壤中真菌数量为8.5×103CFU/g，N处理的土壤中真菌数量为6.9×103CFU/g，A处理的土壤中真菌数量为4.6×103CFU/g，B处理的土壤中真菌数量为 2.8×103CFU/g，CK与各处理之间的土壤中真菌数量差异较明显。

3 讨论与结论

3.1 精胺代谢对连作番茄根结线虫病的生长势的影响

经过不同处理后，从南方根结线虫对连作番茄生长势的影响来看，N处理番茄根系上的根结直径最大，为0.08 cm；A处理的番茄根结数量最少，为20.75个，此时形成的根结最大直径仅为0.03 cm，茎粗最大，因此，从连作番茄的长势和抑制根结的形成来看，A处理的土壤对连作番茄根结线虫病的抑制效果较好。

3.2 精胺代谢对连作番茄根结线虫病几种抗氧化酶活性的影响

番茄感染南方根结线虫病之后，超氧化物歧化酶活性与健康土壤对照相比有所增强，喷施精胺能够提高番茄的超氧化物歧化酶活性，当精胺浓度为 1.0 mmol/L 时，超氧化物歧化酶浓度增加得最多，能够有效提高番茄对根结线虫病的抗性。根结线虫侵染后，番茄的过氧化物酶活性升高，1.0、3.0 mmol/L 精胺处理后，番茄的过氧化物酶活性明显增强。本研究结果表明，在南方根结线虫侵染后，精胺浓度不同对番茄丙二醛含量影响较大，健康土壤对照的番茄丙二醛含量比其他处理组低，精胺处理后的土壤栽培的番茄丙二醛含量比N处理低，说明精胺处理对连作番茄根结线虫病有一定的抑制作用。南方根结线虫处理后，与CK相比，番茄的过氧化氢酶活性降低，经过不同浓度精胺处理后的过氧化氢酶活性与CK组差异明显，当精胺浓度为3.0 mmol/L时，过氧化氢酶活性最低，为1.75 U/g。在植物与病原物互作过程中，这些过氧化物酶活性的升高可能是由于合成了对细胞有毒的产物，也可能由于诱导植物细胞壁发生了改变，形成物理屏障物，引起细胞死亡，抑制病原菌侵染，从而参与了植物的抗病作用。

3.3 精胺代谢对连作番茄根结线虫病土壤微生物的影响

连作会导致微生物区系发生改变，土壤病原真菌数量增加，有益拮抗菌数量减少，由细菌型土壤向真菌型土壤转化；土壤病虫基数增加，根际土壤中放线菌密度降低等一系列不良影响的发生，严重影响了番茄的生长发育，从而导致大幅度减产甚至绝收[15]。土壤中存在着大量的微生物，在一定程度上土壤微生物群落调节着土壤乃至整个生态系统的功能。土壤微生物以细菌的种类和数量最多[16]。细菌在土壤营养元素循环、有机物质的形成和分解、肥力的保持和提高、生态环境的改善、植物的生长发育和作为病虫害防治等方面均起着极其重要的作用[17]。本研究结果表明，精胺及其代谢物对番茄连作中根结线虫病有一定的抑制作用。

本研究结果表明，精胺在番茄短期连作中能够促进土壤中细菌数量增加，真菌数量减少，番茄叶片中各种酶活性逐渐上升，番茄生长势良好，并且能够减少植物根结线虫病害的发生，提高土壤肥力，使微生态环境向良性方向发展，这为将来的研究提供一个参考和方向，对茄科植物的生产实践也具有一定的指导意义。