miR-499对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

岳 莹，吕风华，陈玉磊，王 卓，司澳洋

新乡医学院第一附属医院心血管内科 河南卫辉 453100

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)严重威胁人类健康。临床上对于AMI的治疗主要是通过溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)、冠脉搭桥等手段快速恢复缺血心肌的血液供应，避免持续性的心肌缺血缺氧；然而当缺血心肌血供恢复后，局部缺血心肌组织损伤反而会加重，引起心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。如何有效地避免缺血再灌注所引起的心肌细胞损伤是当前临床AMI治疗过程中亟待解决的问题。相关研究[1-2]显示，MIRI所引起的心肌损伤与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/Akt)等信号分子的活化有密切关系。MicroRNAs (miRNAs) 是一类含约22个核苷酸的非编码小分子单链RNA，已有研究[3]证实有多种心肌特异性miRNA在MIRI过程中异常表达，人类miR-499位于MYH7B基因内含子19(染色体20q11.2)的位置，以反向平行的方式进行转录，参与心脏的发育、心肌肥厚、心力衰竭及MIRI等病理生理过程。相关研究[4]提示，miR-499的表达可能在AMI过程中起重要调节作用。虽然PI3K/Akt信号通路及miR-499在心肌梗死中均有研究，但它们之间的关系却鲜有报道。该研究旨在利用原代心肌细胞急性缺氧/复氧模型，模拟MIRI，观察miR-499在急性缺氧/复氧条件下对心肌细胞凋亡的影响，并探讨其与PI3K/Akt信号通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1动物及试剂2～3日龄新生大鼠由新乡医学院动物实验中心提供；Ⅱ型胶原酶、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM高糖培养基和低糖培养基(北京索莱宝生物科技有限公司)；青霉素、链霉素(上海远慕生物科技有限公司)；miR-499激动剂agomir(广州锐博生物科技有限公司)；PI3K特异性阻断剂LY294002(美国Pepro Tech公司)；RNAiso-Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)[宝生物工程(大连)有限公司]；荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；Caspsae-3抗体(英国Abcam公司)；PI3K/Akt及磷酸化PI3K/Akt信号通路抗体(美国CST公司)；HRP 羊抗兔 IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2原代心肌细胞的培养取2～3日龄新生大鼠，浸入体积分数75%乙醇中消毒，打开胸腔，取出心脏，放入高糖培养基中，去除血管、心房肌等多余组织，清洗数遍后将心室肌剪碎；加入1.5 mL消化酶，在培养箱中消化8 min(每4 min取出振荡1次)，取上清于50 mL离心管中，并向离心管中加入1.5 mL含体积分数10%胎牛血清的高糖培养基终止消化；重复上述步骤直至消化完全，用200目滤网过滤，分离成单个细胞，1 200 r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的高糖培养基制成细胞悬液。采用差速贴壁法分离心肌细胞与成纤维细胞。吸取上层未贴壁细胞，接种于培养皿中，用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养，2 d后换液，可观察到细胞跳动，取对数生长期细胞进行实验。

1.3细胞缺氧/复氧模型的构建参考文献[5]的方法，将无血清低糖DMEM培养基置于37 ℃低氧密闭培养箱中，持续通入体积分数95% N2+体积分数5%CO2混合气体3 h(流速为2 L/min)，充分饱和无血清低糖DMEM培养基。将上述培养基迅速置换培养皿中的高糖培养基，并将培养皿放入低氧装置中培养3 h；之后将培养液更换为含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基并置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中复氧4 h。

1.4实验分组及处理取心肌细胞，随机分成正常对照组(37 ℃、体积分数5%CO2、体积分数95%空气正常培养)、缺氧/复氧组(A/R组，按照上述步骤构建模型)、缺氧/复氧+miR-499 agomir预处理组(Agomir组，在缺氧前48 h，于培养基中加入终浓度为50 nmol/L[6]的miR-499 agomir构建模型)和缺氧/复氧+miR-499 agomir+PI3K特异性阻断剂LY294002组[Agomir+LY294002组，缺氧前于培养基中加入 LY294002(10 μmol/L)[7]，余同Agomir组]4组。

1.5各组心肌细胞活力的MTT检测调整细胞密度至1×107L-1；取150 μL/孔接种于96孔板中，3 d后随机分组给予对应处理后弃培养基，细胞分组及处理同1.4。每孔加入90 μL含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基和10 μL MTT，37 ℃培养4 h，弃上清，于避光条件下加入150 μL DMSO，摇床上振荡10 min，利用酶标仪检测各孔吸光度值(A值)(检测波长为490 nm)。心肌细胞活力=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.6各组细胞中miR-499、PI3KmRNA表达的荧光定量PCR检测引物设计见表1，miR-499上下游引物及U6上下游引物由广州锐博生物科技有限公司设计合成；采用Trizol提取实验各组心肌细胞总RNA，检测RNA浓度，按试剂盒说明书逆转录为cDNA，再行荧光定量PCR。PCR反应条件：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃融解；50 ℃ 30 s降温。采用 2-ΔΔCT法计算PI3K、miR-4991 mRNA的表达水平。实验均重复5次。

表1 引物设计

1.7各组细胞中Caspase-3及PI3K/Akt蛋白表达的Westernblot检测向心肌细胞中加入150 μL RIPA裂解液，加入PMSF(检测磷酸化Akt和PI3K时需加入蛋白磷酸酶抑制剂)，利用BCA试剂盒检测蛋白浓度，以RIPA裂解液及Loading buffer调整蛋白浓度。配置分离胶及积层胶进行电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，一抗封闭过夜，二抗孵育1 h，ECL化学发光法使条带显影，保存图片，采用Image J图像分析软件测定灰度值。实验重复5次。

1.8统计学处理采用SPSS 22.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较4组心肌细胞活力、心肌细胞中PI3K、miR-499 mRNA相对表达量及细胞中Caspase-3、PI3K/Akt蛋白表达量的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组心肌细胞活力、心肌细胞中PI3K及miR-499mRNA相对表达量的比较见表2。由表2可知，与正常对照组相比，A/R组心肌细胞活力下降，miR-499 mRNA表达量下降；与A/R组相比，Agomir组心肌细胞活力增加，PI3K mRNA表达增加。

表2 4组心肌细胞活力、心肌细胞中PI3K及miR-499 mRNA相对表达量的比较

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与A/R组相比，P<0.05；△：与Agomir组相比，P<0.05

2.2 4组心肌细胞中Caspase-3、PI3K/AKt蛋白表达量的比较见图1、表3。由表3可知，与正常对照组相比，A/R组Caspase-3蛋白表达增加，p-PI3K、p-Akt表达量减少；与A/R组相比，Agomir组蛋白Caspase-3蛋白表达减少，p-PI3K、p-Akt表达量增加；与Agomir组相比，Agomir+LY294002组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量减少。

1：正常对照组；2：A/R组；3：Agomir组；4：Agomir+LY294002组

图1 4组心肌细胞中Caspase-3、PI3K/Akt蛋白表达量的比较

表3 4组心肌细胞中Caspase-3、PI3K/Akt蛋白表达量的比较

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与A/R组相比，P<0.05；△：与Agomir组相比，P<0.05

3 讨论

miRNAs是一类含约22个核苷酸的非编码小分子单链RNA，相关文献[8-9]报道某些miRNAs表达的上调或下调可影响部分心血管疾病的发生和发展，纠正这些miRNAs的异常表达可使某些心血管疾病得以逆转，这为治疗心血管疾病提供了新的靶点。Li等[10]的研究结果显示，缺氧诱导培养的心肌细胞中miR-499的表达降低，这与本研究结果一致。Wang等[11]研究结果显示，miR-499通过保护心肌细胞免受H2O2诱导的细胞凋亡而具有心脏保护作用；在大鼠心肌细胞过表达 miR-499时，可抑制线粒体凋亡从而增加细胞存活率。Wang等[12]的研究显示，miR-499可通过钙依赖磷酸酶所介导的动力相关蛋白-1去磷酸化而抑制心肌细胞凋亡。Zhu等[13]的研究显示，miR-499的心脏保护作用可能是通过程序性细胞死亡因子4来实现。本研究结果显示，与正常对照组相比，A/R组miR-499表达量减少，Caspase-3表达量增加；而增加miR-499的表达，Caspase-3表达量下降，提示在缺氧/复氧情况下miR-499表达量下降，增加miR499的表达可减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞的凋亡。

PI3K/Akt信号转导通路是体内最重要的细胞生存相关激酶途径之一，其与心肌细胞存活和凋亡密切相关，被称为再灌注损伤补救激酶通路[14]。Akt是PI3K下游靶点分子，它的Thr308位点磷酸化和Ser473羧基端磷酸化，能进一步使下游靶分子(如Bad和Caspase-9等)磷酸化而失活，调控抗凋亡相关基因的转录，促进细胞存活[15-17]。相关动物实验(兔、大鼠、犬等多种心肌缺血再灌注模型)[18-20]证实：PI3K/Akt通路的活化可发挥心肌保护作用，抑制心肌细胞凋亡。MIRI时会激活多种保护性通路减轻心脏损害，有研究[21]结果显示，干预PI3K/Akt等信号的表达可有效地预防MIRI所造成的心肌细胞损伤。本研究的结果显示，与正常对照组相比，A/R组PI3K mRNA表达量、p-PI3K及p-Akt蛋白表达量减少；但经Agomir处理(增加miR-499的表达)后，与A/R组相比，Agomir组PI3K mRNA表达量、p-PI3K及p-Akt蛋白表达量增加；提示miR-499可能是通过PI3K/Akt信号通路来减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。而加入PI3K特异性阻断剂LY294002后，miR-499的这种细胞保护作用被抑制，这一结果再次验证了miR-499可能是通过PI3K/Akt信号通路抑制缺氧/复氧所诱导的心肌细胞的凋亡。

本研究结果显示miR-499在MIRI中发挥重要作用，过表达miR-499可减少缺血再灌注损伤中心肌细胞的凋亡，而miR-499可能是通过激活PI3K/Akt信号通路产生这种心肌保护作用，但miR-499是如何激活PI3K/Akt信号通路而产生心肌保护作用仍需进一步研究。