miR-106a-5p及其靶基因在结肠癌患者手术前后的表达差异及临床意义*

田 衍，舒 若，曾玉剑，王昆华，罗华友

(1.昆明医科大学第一附属医院胃肠与疝外科，昆明 650032;2.云南省消化病研究所,昆明 650032；

3.昆明医科大学第一附属医院云南省工程技术研究中心,昆明 650032；

4.昆明医科大学第一附属医院昆明市消化病工程技术研究中心,昆明 650032)

近年来，参与调节基因表达的微小RNA (miRNA)在癌症研究方面取得了许多新的进展，并证实其参与了多种肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程。结肠癌是世界范围内病死率位居前三的恶性肿瘤，其发病机制仍不明确。目前，结肠癌的治疗主要依赖于完整系膜切除术(CME)这类外科手术[1-2]。但是，结肠癌患者术后局部复发和远处转移情况时有发生，生存率也十分堪忧。近期研究表明，miRNA在结肠癌的早期诊断、治疗预后和生物靶标等方面可能存在潜在的临床价值[3-5]。miR-106a-5p作为miR-17家族的一员，在胃癌[6-7]、大肠癌[8-9]、结直肠癌[10-11]、食管鳞癌[12]、卵巢癌[13]和乳腺癌[14]等肿瘤的相关研究中均有报道。新近研究还发现了一些miR-106a-5p的新靶向基因，如长链非编码RNA FER1L4[15-16]、转化生长因子Ⅱ型受体(TGFBR2)[17-18]、Fas激活的丝氨酸/苏氨酸激酶(FASTK)[19]和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)[20-21]等。本研究比较分析miR-106a-5p及其靶基因在结肠癌患者和健康人群血浆中的表达水平差异，以及行CME手术后在结肠癌患者血浆中的表达变化，旨在为结肠癌的临床诊断和治疗提供一些参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2010年8月至2014年8月在昆明医科大学第一附属医院接接受CME治疗的结肠癌患者100例作为实验组，术前均未行放疗或化疗。同时选取100例健康志愿者作为对照组。实验组平均年龄(57.21±8.74)岁，其中男53例，女47例。对照组平均年龄(55.02±7.95)岁，其中男48例，女52例。两组人群的年龄和性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血浆采集 静脉抽取实验组手术前血液，手术后第7天血液，对照组血液各2 mL。血液标本快速转入乙二胺四乙酸(EDTA)采血管，室温静置约30 min后，4 ℃下1 200×g离心10 min，转移上清液至新的离心管。然后，4 ℃下12 000×g离心10 min，去除细胞成分，收集上层血浆至新的离心管，-80 ℃保存备用。

1.2.2血浆总RNA提取及逆转录 各取200 μL上述血浆样本，按GenEluteTMPlasma/Serum RNA Purification Mini Kit (SIGMA-ALDRICH)的方法步骤抽提血浆中的总RNA，利用荧光分光光度计(Thermo Fisher)测定血浆RNA浓度。提取的RNA置于-80℃保存备用。参照Taq-Man miRNA Reverse Transcription试剂盒(Applied BioSystems)的说明合成cDNA。

1.2.3RT-qPCR检测 利用SYBR Master mix 试剂盒(Toyobo)在ABI 7500实时荧光定量PCR仪(Applied BioSystems)上对上述合成的cDNA进行RT-qPCR检测。每个反应重复3次。待检测mRNA或基因的引物序列见表1。以U6小环RNA作为内参[22-23]，结果采用2-△△Ct相对定量法计算[24]。

1.3CME手术方法及术后随访 结肠癌患者遵循CME结肠癌根治原则进行手术治疗[1-2]。分别按miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的相对表达水平将结肠癌患者划分为高值组和低值组。相对表达水平大于或等于平均相对表达水平的患者归为高值组，相对表达值小于平均相对表达值的患者归为低值组。术后3年内平均每3个月随访1次，记录高值组与低值组肿瘤局部复发、远处转移和患者死亡等情况。

表1 用于RT-qPCR检测用的引物序列

2 结 果

2.1结肠癌患者手术前后miR-106a-5p及其靶基因的表达量比较 在实施手术前，实验组结肠癌患者血液中miR-106a-5p的表达量显著高于对照组，而结肠癌患者血液中FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表达量则显著低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。行CME后，miR-106a-5p的表达量显著下调(P<0.01)，而FER1L4、TGFBR2和FASTK的表达量则显著上调(P<0.05)，PTEN的表达变化差异无统计学意义。见图1。

2.2结肠癌患者血浆中miR-106a-5p及其靶基因的表达与临床病理特征的关系 结肠癌患者血浆中miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的相对表达量与性别、年龄和肿瘤发生部位均无关，见表2。miR-106a-5p与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)；FER1L4与分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05)；TGFBR2与分化程度和远处转移有关(P<0.05)；FASTK与淋巴结转移有关(P<0.05)；PTEN与肿瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05)。

图1两组血液中miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表达量

表2 结肠癌临床病理特征与miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的相对表达量

2.3高值组和低值组结肠癌患者复发率和生存率比较 miR-106a-5p低值组患者的复发率低于高值组(P<0.05)，生存率优于高值组，但差异无统计学意义(P>0.05)。FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的高值组患者的复发率低于低值组，生存率优于低值组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 miR-106a-5p及其靶基因的表达与复发率和生存率的关系

3 讨 论

结肠癌的发病需要经历不典型增生、腺瘤、癌变及肿瘤转移等过程，miRNA及其靶基因在每一个阶段均表现出差异的表达模式。研究miRNA与靶基因之间的相互调控关系，可以了解肿瘤的发生机制，为癌症治疗提供新的靶点[4-5]。目前，在结肠癌方面研究较多的miRNA主要是miR-21[22]和miR-106a[18,25]。而在胃癌和结直肠癌等癌症报道中，miR-106a可能与抑癌基因FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN等存在相互调控关系[15,18-19]。

本研究利用RT-qPCR技术对miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN在结肠癌患者血浆中的表达进行了检测。结果显示，实验组结肠癌患者手术前血浆中miR-106a-5p的表达显著高于对照组，而FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表达显著低于对照组。这与它们分别在胃癌和结直肠癌等癌症中的表达情况基本类似[8-9]。实验组结肠癌患者行CME手术后，检测其血浆中miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表达量，结果显示，术后miR-106a-5p的表达量比术前显著下调(P<0.01)，术后FER1L4、TGFBR2和FASTK的表达量比术前显著上调(P<0.05)。这说明miR-106a-5p与抑癌基因FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表达水平是负调控关系，与之前报道的miR-106a-5p与FER1L4在肿瘤组织中竞争表达的结果是一致的[15-16]。这些结果说明miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN可能参与了结肠癌的发生和发展等过程。

本研究进一步分析了miR-106a-5p及其靶基因的表达量与临床病理特征的关系。结果显示，miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2和FASTK的相对表达量与患者性别、年龄、肿瘤发生部位和肿瘤大小均无关(P>0.05)，只有PTEN的相对表达量与肿瘤大小可能有一定的相关性(P<0.05)。miR-106a-5p的相对表达量与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移均有关(P<0.05)。其余4个靶基因的相对表达量则主要与分化程度(FER1L4、TGFBR2和PTEN)和淋巴结转移(FER1L4、FASTK和PTEN)有关(P<0.05)。按相对表达量分组分析结果显示，miR-106a-5p低表达组的术后复发率低，生存率高；FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN高表达组的术后复发率低，生存率高。以上分析表明，miR-106a-5p及其靶基因具有作为检测肿瘤生物标志物的潜力[25]。由于无创、稳定性好、检测结果可靠等特点[26]，对miR-106a-5p及其靶基因的检测可能有助于结肠癌的早期诊断、辅助治疗和患者预后。