对氧磷酶1 rs662位点单核苷酸多态性与氟骨症关系的病例对照研究*

刘 俊陶 娜罗明江，赵 训，杨 胜，张元梅，王克跃△

(1.遵义医学院预防医学实验教学中心，贵州遵义 563006； 2.贵州省预防医学实验教学示范中心，贵州遵义 563006；3.遵义医学院附属医院药剂科，贵州遵义 563006； 4．贵州省遵义市第四人民医院院感科 563004；5.贵州省毕节市织金县疾病预防控制中心慢性病防治科 552100)

地方性氟中毒是人体长期在特定地理环境中摄入了过量的氟而造成的全身慢性蓄积性中毒，主要表现为氟斑牙和氟骨症，其中氟骨症是致残、致瘫、降低劳动能力的主要病变。曾报道贵州省地方性氟中毒区人口大概1 900万人，氟骨症患者约65万人[1]。如此严重的地方病对病区居民的身体健康和经济发展带来重大影响[2]。既往研究发现氟暴露地区不是所有人均会患氟骨症，氟骨症的发生可能与遗传易感性存在密切关系[3-4]。研究证实，氧化应激和内质网应激都有可能为地方性氟中毒中氟骨症的发病机制[5-6]。因此，氧化应激相关基因可能与氟骨症易感性之间存在关联。对氧磷酶(Paraoxonase，PON)是一种钙离子依赖性磷酸酯酶，能够阻止脂质过氧化的生成，在氧化应激中起重要作用[7]。PON基因家族包括PON1、PON2和PON3等至少3个基因，其中PON1是对氧磷酶家族研究最多且最知名的成员。PON1 基因位于 7号染色体长臂 7q21.3-22.11上,长约259 kb，包含8个内含子和9个外显子[8]。既往研究发现，PON1与氧化应激相关疾病，如骨质疏松症、冠状动脉疾病、卒中、糖尿病和代谢综合征等疾病有关[9-10]。目前尚少有研究探讨PON1基因多态性与氟骨症之间的关系。因此，本次研究旨在通过病例对照研究方法，探讨PON1基因rs662位点单核苷酸多态性与氟骨症之间的关系，为氟中毒的早期防治提供人群研究资料和理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 在贵州省毕节市织金县招募195例氟中毒患者，在上述地区招募195例无骨骼和牙齿相关疾病的成年人作为对照组。(1)纳入与排除标准： 纳入病例为根据诊断标准确诊的氟骨症患者。氟骨症按《地方性氟骨症临床分度标准》(GB16396-1996)，结合流行病学和临床表现症状，由氟骨症专家做出诊断。纳入的所有对象排除各种病理性骨折、高能量(暴力性)骨折及其他暴力所致骨折。且排除肿瘤、卒中、肝硬化等重要疾病及认知或精神异常。(2)对照纳入标准：所有对象要求在招募地居住时间在10年或以上，年龄大于20岁。本研究获遵义医学院伦理委员会伦理同意书，所有研究对象于调查前均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1现场调查 问卷调查由经过统一培训的调查员面对面询问完成，调查内容由4部分构成，一般人口学资料包括年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度和经济收入等；生活方式如吸烟、饮酒、饮茶和锻炼；氟中毒相关情况调查包括炉灶是否改良、燃料类型、是否炉火烧烤食物及食用前是否淘洗等；膳食调查包括主食、蔬菜水果、肉类等。

1.2.2基因组分型 调查当天采用乙二胺四乙酸抗凝管采集研究对象的外周静脉血 5 mL，-70 ℃保存备用。采用天根全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA。基因分型用高通量TaqMan-MGB RT-PCT技术进行检测。基因分型使用Roche LightCycler480 Software实时荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)。PCR反应体系为6 μL:2×TaqMan通用PCR混合物0.25 μL，20×单核苷酸多态性(SNP)基因分型混合物0.25 μL，ddH2O 4.5 μL，DNA 1 μL。PCR反应条件为95 ℃ 4 min；95 ℃ 7 s，60 ℃ 40 s，40个循环。每个96孔板设置2个空白对照。用Roche LightCycler480 Software进行基因分型。

1.2.3尿氟检测 现场调查时从每个对象留取10 mL尿液存于-70 ℃保存备用。采用离子选择电极来测尿氟含量，仪器HQ40d Portable Meter (Hach,USA)，吸取1 mL尿液与24 mL去离子水混合，加入氟化物调节缓冲粉，然后用测得的值通过相应的比例算出每名参与者尿氟水平，根据WS/T 256-2005标准，正常尿氟值浓度低于1.6 mg/L。

1.2.4质量控制 数据采用Epidata3.0软件进行双人录入并核对，膳食问卷采用食物模型辅助调查，研究对象的诊断采用统一标准由同一人完成。两人分别采用盲法判断基因型，随机抽取5%的实验样品进行重复分型，结果一致率为100%，对无法自动分型的样品，进行重复检测，剔除重复检测仍无法分型的样品。

2 结 果

2.1一般情况 本次研究共收集氟骨症195例，对照组195例。病例组平均年龄为(49.86±12.67)岁，女性占48.20%；对照组平均年龄(46.68±14.35)岁，女性占58.97%，两组年龄和性别差异有统计学意义(P<0.05)。病例组rs662 位点基因型GG、GA和AA分布频率分别为48.21%、46.15%、5.64%，而对照组的频率分布分别是44.10%、42.56%、13.34%，差异有统计学意义(P<0.05)。经检验，rs662位点基因型频率分布符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2=0.695，P=0.405)。此外，病例组与对照组之间在尿氟水平、民族、婚姻、文化程度、炉灶改良、烘烤粮食、使用燃料类型方面差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2rs662位点不同遗传模式与氟骨症的关系 将rs662位点基因型分成5种不同的遗传模式，单因素分析发现，共显性模式、显性模式和累加模式与氟骨症有关，校正年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度、吸烟、饮酒、饮茶、改良炉灶、使用燃料种类、烘烤粮食、尿氟及钙摄入水平后，这种关联仍然存在。rs662 AA基因型携带者较GG基因型携带者氟骨症风险降低62%(OR=0.38,95%CI:0.15～0.95)； GG+AG携带者患氟骨症风险是AA携带者的2.49倍(OR=2.49，95%CI:1.04～6.01)； AG型携带者患氟骨症风险是AA携带者的2.59倍(OR=2.59，95%CI:1.05～6.40)。见表2。

表1 研究对象基本特征

续表1 研究对象基本特征

表2 rs662位点单核苷酸多态性在病例组与对照组分布情况及风险估计

a：未校正OR；b：校正年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度、吸烟、饮酒、饮茶、改良炉灶、使用燃料种类、烘烤粮食、尿氟及钙摄入水平

表3 rs662位点单核苷酸多态性与性别、民族、尿氟及钙摄入水平的关系(n)

膳食钙摄入水平中位数：475 mg/d

2.3rs662位点单核苷酸多态性与性别、民族、尿氟及钙摄入水平的关系 rs662位点基因型频率在汉族、少数民族之间分布不同，存在民族差异，汉族AA型比例明显高于少数民族(P<0.05)；此外正常尿氟水平与高尿氟水平之间基因型分布存在明显差异(P<0.05)。而基因型频率分布不存在性别差异(P>0.05)，不同基因型的膳食钙摄入水平无明显不同(P>0.05)。见表3。

2.4rs662位点单核苷酸多态性与性别、民族、尿氟及钙摄入水平交互作用 将性别、民族、尿氟和钙摄入水平进行分层分析，多因素Logistic回归显示正常尿氟水平时AG+AA基因携带者对氟骨症具有保护

表4 rs662位点单核苷酸多态性与性别、民族、尿氟及钙摄入水平交互作用分析

a：未校正OR；b：校正年龄、性别、民族、婚姻状况、文化程度、吸烟、饮酒、饮茶、改良炉灶、使用燃料种类、烘烤粮食、尿氟及钙摄入水平

作用，而较高尿氟水平则没有，rs662位点基因多态性与尿氟存在交互作用(P<0.05)；此外发现汉族人群AG+AA基因携带者对氟骨症具有保护作用，而少数民族没有，rs662位点基因多态性与民族存在交互作用(P<0.05)。未发现rs662位点单核苷酸多态性与性别和民族水平存在交互作用(P>0.05)。见表4。

3 讨 论

氟骨症是异常大量的氟化物积聚骨组织中的一种慢性代谢性骨病，以成骨活跃和骨转换加速为病理基础，包括骨硬化、骨软化、骨质疏松、骨周软组织骨化，以及软骨和关节退行性改变[11-12]。氧化应激被认为是氟骨症发生的重要机制[5-6]。有研究证实氧化应激相关基因多态性与氟中毒发生有关，如髓过氧化物酶基因[13]。PON1通过水解脂质过氧化物来减缓脂质过氧化，而且可降低氧自由基的积累，特别是脂质氢过氧化物[14]。但PON1基因多态性与氟中毒关系的研究还少见报道。本研究发现，共显性模式AA型携带者患氟骨症风险较GG型携带者显著降低，而GG+AG及AG携带者患氟骨症风险明显高于AA基因型携带者，提示PON1 rs662 基因多态性与氟骨症的风险相关。此前多项研究表明PON1基因多态性与骨健康有关。YAMADA等[7]发现，PON1 rs662单核苷酸多态性与日本老年女性骨密度有关，从而具有更高的骨质疏松风险。此外有研究也证实，PON1基因多态性与骨质疏松存在关联[14-15]。越来越多的证据表明，脂质氧化和骨骼生物学之间存在生化关系，增加的脂质氧化引起氧化应激并减少Wnt信号，从而减少成骨细胞的分化和存活，通过cAMP介导的途径诱导破骨细胞分化[16]。MACKINNON等[17]发现PON1基因多态性与多个骨转换标志物有关，PON1可催化分解过氧化物，减少脂质过氧化产物的积累，降低氧化应激对骨形成的影响。虽然PON1可以通过参与脂质氧化来影响骨代谢，但确切的机制还需要进一步研究证实。

本研究发现，rs662基因频率在汉族与少数民族分布之间存在差异，且民族差异修饰rs662单核苷酸多态性与氟骨症之间的关联。杜静静[18]研究表明rs662基因型频率在汉族和维吾尔族的分布存在明显差异。也有研究发现PON1基因多态性与日本人骨密度存在关联[7]，而未在韩国人群发现此关联[14]。有关该基因多态性与卒中风险的meta分析也证实该基因多态性存在种族差异，亚洲人GG+AG携带者缺血性卒中风险显著增加，而高加索人则无影响[19]，在与糖尿病的关联中也有类似发现，本研究结果与此相似。此外，本研究发现，rs662基因型在尿氟是否正常的患者间分布存在明显差异，进一步分层分析也发现该基因多态性与尿氟存在交互作用，提示基因与环境存在交互影响。高尿氟水平反映氟暴露水平较高，可能在高氟环境暴露下，PON1的氧化应激调节作用已失控，导致其失去保护作用，但需要进一步研究证明。

综上所述，PON1 rs662位点单核苷酸多态性与氟骨症发生有关，且民族和氟暴露水平修饰该基因多态性与氟骨症的关联。这在一定程度上，为探索氟中毒个体化预防提供了理论依据和参考。由于本研究没有测定PON1活性，尚不确定PON1活性是否受多态性影响。本研究样本量相对较小，rs662位点单核苷酸多态性与氟骨症的关系还需要进一步扩大样本量进行研究验证，rs662位点单核苷酸多态性在氟骨症机制中的具体作用还需进一步深入研究。