液体培养富硒富锗蜜环菌的探讨

贺建超，马英辉，李利军，卢美欢

(陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

蜜环菌(Armillariellamellea)属真菌界、担子菌门、担子菌纲、伞菌目、口蘑科、蜜环菌属，同兰科天麻(Gastrodiaelata)互为寄生。天麻染此菌后，菌索迅速消失，进而共同生长发育。天麻开花结籽后，蜜环菌又迅速吃掉天麻块茎。夏秋雨季蜜环菌常见于针、阔叶树干基部丛生，使树根腐至可发荧光。蜜环菌深层发酵物功同天麻，有息风镇痛，治神经性头疼，高血压性头痛之效。均对中枢神经起镇静作用，可与中枢抑制剂，戊巴比妥纳协同作用，延长小白鼠睡眠。与中枢兴奋剂五甲烯四氢唑拮抗，增进大脑和冠状动脉血流量。舒筋活络，强筋壮骨。治腰腿疼痛，半身不遂，佝偻症[1]。

有机硒具有抗氧化、抗衰老、抗癌、提高机体免疫力等多种生物学功能。我国硒资源储量丰富，但地理分布不均匀，城乡居民硒摄入量不足，是公认的缺硒大国。近十多年来，我国富硒农产品备受市场关注和青睐，呈现出广阔的发展前景[2]。有机锗具有抗癌诱发机体干扰素的产生降低血压提高机体免疫等功能并且毒性极低， 由于名贵药材如灵芝、猴头菌、蜜环菌等中有机锗含量较低，近年来国内外有研究报道用二氧化锗作为添加剂培养食用和药用真菌，获得高含量的生物源有机锗[3]。笔者选用不同的培养基，添加不同含量的亚硒酸钠和二氧化锗进行研究。现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

蜜环菌AY3菌株，系陕西省微生物研究所真菌研究中心保藏菌种。

综合PDA液体培养基[4]。土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，硫酸镁0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾1 g，维生素B1为10 mg，水1 000 mL。

添加剂亚硒酸钠(化学纯，上海试剂厂)；二氧化锗(高纯试剂，上海试剂厂)。

1.2 方法

将综合PDA液体培养基中的碳源葡萄糖替换成麦芽糊精、红薯淀粉、土豆淀粉、可溶性淀粉，分装在三角瓶中，每瓶100 mL，于1.2 kg·cm-2灭菌30 min。冷却至25 ℃，接种蜜环菌，25 ℃下静置培养21 d，过滤菌索体，烘干称重。

采用综合PDA液体培养基分装三角瓶，每瓶100 mL，在1.2 kg·cm-2压力下灭菌30 min。冷却至25 ℃，接种蜜环菌，25 ℃下培养7 d，分别添加亚硒酸钠0、50、100、150、200、250、300、350、400 mg·L-1[5-6]；分别添加二氧化锗0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mg·L-1，25 ℃下静置再培养14 d[7-8]，过滤菌索体，烘干称重。

蜜环菌粗多糖提取方法[9-10]。称取蜜环菌菌索粉5 g，加入50 mL蒸馏水，搅拌均匀，于95 ℃水浴中保温4 h，中间每隔20 min超声震动20 s，完成后3 500转离心20 min，得上清液(1)。再加入50 mL蒸馏水搅拌均匀，于95 ℃水浴中保温4 h，中间每隔20 min超声震动20 s，再提取1次，离心后得上清液(2)。将上清液(1)和(2)合并，加入总体积3倍的无水乙醇，于4 ℃冰箱静置沉淀48 h。3 500转离心后得沉淀于80 ℃烘干，即为蜜环菌粗多糖样品。

蜜环菌粗多糖含量测定采用苯酚硫酸法[11]。精密称取蜜环菌菌索粉1 g，置索氏提取器中，先用无水乙醇加热回流后，再加水90 mL，加热回流提取至无色，将提取液转移至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 mL，加入无水乙醇150 mL摇匀，4 ℃放置12 h取出，离心，弃上清液加水溶解，并定量转移至50 mL容量瓶中稀释至刻度。

标准曲线绘制。精密称取葡萄糖对照品配成0.1 mg·mL-1溶液，用移液枪分别吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，置10 mL具塞试管中，加水至2 mL，加入1 mL 5%苯酚，再缓慢加入5 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴显色20 min，冷却后490 nm测吸光值。标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线浓度

样品测定。取蜜环菌提取液0.5 mL，置10 mL具塞试管中，加水至2 mL，加入1 mL苯酚，再缓慢加入5 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴显色20 min，冷却后490 nm测吸光值。重复3次，取平均值计算多糖含量。

2 结果与分析

2.1 碳源对蜜环菌发酵的影响

由图2可知，葡萄糖、麦芽糊精、土豆淀粉、红薯淀粉、可溶性淀粉，蜜环菌菌索生物量干重分别为14.15、18.05、11.95、13.40、14.45 g·L-1。

图2 不同碳源对蜜环菌发酵的影响

2.2 亚硒酸钠对蜜环菌的影响

由图3可知，添加亚硒酸钠0、50、100、150、200、250、300、350、400 mg·L-1，蜜环菌菌索生物量干重分别为18.0、19.2、20.1、21.3、22.2、23.1、25.6、24.3、20.2 g·L-1，蜜环菌粗多糖含量分别为18.63、18.61、19.53、20.01、21.20、22.30、23.60、22.30、20.10 mg·g-1。

图3 添加硒对蜜环菌的影响

2.3 二氧化锗对蜜环菌的影响

由图4可知，添加二氧化锗对照0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mg·L-1，蜜环菌菌索生物量干重分别为10.4、9.0、10.75、10.7、10.5、11.3、12.4、12.8、13.0、13.4、15.6、15.6、15.0 g·L-1，蜜环菌粗多糖含量5.82、5.81、6.04、6.10、5.98、6.12、6.14、6.20、6.21、6.35、7.86、7.46、7.15 mg·g-1。

图4 添加锗对蜜环菌的影响

2.4 混合添加对蜜环菌的影响

添加硒300 mg·L-1和锗500 mg·L-1，蜜环菌生长不良，菌索生物量为3.5 g·L-1。硒和锗均添加1.5 μg·mL-1则生长良好，蜜环菌菌索生物量为12.95 g·L-1。

蜜环菌多糖含量。对照多糖含量为20 mg·g-1，添加硒100 mg·L-1后多糖含量为30 mg·g-1，添加锗400 mg·L-1后多糖含量40 mg·g-1，添加硒100 mg·L-1和添加锗400 mg·L-1后的多糖含量为36.67 mg·g-1，添加硒150 mg·L-1和添加锗450 mg·L-1后的多糖含量为30 mg·g-1。

3 小结与讨论

在5种碳源中，麦芽糊精的蜜环菌生物量最高，达18.05 g·L-1。当亚硒酸钠添加量350 mg·L-1时，生物量和粗多糖含量开始下降；当亚硒酸钠添

加量为300 mg时，蜜环菌的生物量和粗多糖含量均为最高值。当二氧化锗添加量为600 mg·L-1时，生物量和粗多糖含量开始下降；当二氧化锗添加量为500 mg·L-1时，蜜环菌的生物量和多糖含量均为最高值。

低浓度微克级硒和锗能促进蜜环菌菌丝生长，其机理可能是硒和锗可进入细胞内部并与有机羧酸络合成硒盐和锗盐从而影响细胞某些酶类的活性变化。高浓度的硒和锗混合添加可抑制蜜环菌菌索的生长，低浓度(微克级)的硒和锗混合添加对蜜环菌菌索抑制不大，微克级的硒和锗对人毒性小。每天口服1 g添加1.5 μg·mL-1硒锗蜜环菌菌索粉对人体无毒，具有镇静安眠作用，还具有降低血糖和抗癌防癌的功效。2011年中国营养学会最新推荐成人每天硒摄入量为60～250 μg。建议添加微克级硒和锗，因为高浓度的硒和锗对蜜环菌和人体有毒害作用。