泽泻提取物对大鼠非酒精性脂肪肝的治疗作用

龚 杰，丁 岩，干仲元，王慧雯，朱世敏，李汉清

(上海中医药大学教学实验中心，上海 201203)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史、饮酒折含乙醇量小于140 g/周(女性< 70 g/周)，以肝实质细胞脂肪变和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝硬化，胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病关系密切[1]。中医认为病位在肝，病机特点以脾胃虚弱、肝郁气滞、肝郁脾虚、肾精亏虚等为主，辨证以健脾化湿，疏肝健脾，化痰祛瘀等为治则，经典方剂柴胡疏肝散、二陈汤、茵陈五苓散、香砂六君子汤等，用药频次较高者为山楂、泽泻、柴胡、何首乌、郁金、半夏、陈皮、茯苓、虎杖、大黄等[2]。

泽泻为泽泻科植物泽泻Alismaorientale(Sam)Juzep的干燥块茎，冬季茎叶开始枯萎时采挖，其性寒，味甘、淡，入肾、膀胱经，具有利水渗湿、泄热、化浊降脂等功效，用于小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、高脂血症等病症[3]。现代研究表明泽泻主要化学成分为三萜类化合物(泽泻醇A、泽泻醇B及其衍生物)、倍半萜类化合物(泽泻醇，环氧泽泻烯，泽泻萜醇A，B，C，磺酰泽泻醇A，B，C，D等)、二萜类化合物以及一些类脂和糖类化合物；其主要药理作用包括利尿，抗结石，抗高血压、高血脂，抗动脉粥样硬化，抗脂肪肝，免疫调节等[4-8]。

严伟伦[9]报道了60例患者的临床试验，发现泽泻调脂颗粒方能减轻脾虚痰瘀型非酒精性脂肪肝患者神疲乏力、食物不振、腹胀、四肢困倦、胸胁胀满等症状，其作用机制包括有效改善非酒精性脂肪肝患者的各项血脂水平(TC、TG、LDL-C、HDL-C)以及有效降低非酒精性脂肪肝患者的转氨酶(AST、ALT)等。孙晓娜等[10]报道了100例患者的临床试验，结果发现泽泻泄浊颗粒配合穴位贴敷能减轻非酒精性脂肪肝的严重程度，改善脂质代谢，保护肝功能。

虽然泽泻对于非酒精性脂肪肝的治疗效果已经明确，但是其作用机制报道较少。有研究表明脂质过氧化是内质网应激的诱导因素，内质网应激发生的过程主要是由于缺氧、氧化应激、错误合成蛋白质等多种因素诱发。内质网应激发生后，启动了有关细胞信号转导途径抑制细胞蛋白合成，或者错误合成蛋白，对不能修复的细胞则通过内质网相关细胞凋亡机制诱导其凋亡以维持内环境稳态。过强和过长的内质网应激反应通过细胞能量耗竭、钙稳态失衡、激活内质网应激相关细胞凋亡等机制使器官和组织产生损伤，其中内质网应激相关细胞凋亡是应激状态下细胞损伤的主要机制。NAFLD发病机制的“二次打击”假说又表明氧化应激造成的还原性谷胱甘肽水平下降可以引起JNK信号通路过度活化而诱导脂肪变性细胞死亡[11]。泽泻作为临床有效的抗脂肪肝药物，不同的研究者做出了多方面探索，但却没有该方面机制的系统性研究。本文通过泽泻提取物缓解内质网应激造成肝细胞损伤，从而达到对非酒精性脂肪肝的治疗作用。

本研究通过体外HepG2细胞脂肪变性模型及大鼠非酒精性脂肪肝模型，对泽泻提取物作用后重要生化指标、蛋白水平进行检测，系统地总结泽泻对于非酒精性脂肪肝的药理作用机制，为临床用药进一步提供指导。

1 材料和方法

1.1 实验材料

HepG2人肝癌细胞购自中国科学院干细胞库。共16只雄性SPF级SD大鼠，体重(180±10) g，6 ～ 8周龄，由国家实验动物种子中心上海分中心暨上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[SCXK (沪) 2017-0005]。实验于上海中医药大学实验动物楼SPF动物房进行[SYXK (沪) 2014-0008]，动物饲养于动物房通风鼠笼中，环境温度控制在20℃ ～ 22℃，湿度为50%，12 h∶12 h光亮和光暗循环。SD大鼠共分为四组，每组4只，分别为对照组，400、200、100 mg/kg AOE组。本实验动物伦理编号：SZY201706008。所有操作均按照3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

泽泻提取物由上海中医药大学中药研究中心提供。泽泻提取物的制备：将中药泽泻饮片成粗粉，分别用双蒸水、50%甲醇和纯甲醇煎煮，提取液浓缩回收，制备为泽泻水浸膏、50%甲醇浸膏和泽泻纯甲醇浸膏。用含5%乙醇和7%聚丙烯醋酸纤维素钠溶液作为泽泻提取物增溶剂溶解浸膏，制得浓度均相当于每毫升1.0 g泽泻生药的3种提取物混悬液。

油酸(货号：O1383)、棕榈酸购自Sigma(货号：P5585)；改良油红O染色试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0008)、大鼠天冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0117)、大鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0116)、大鼠甘油三酯(TG)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0195)、大鼠高密度脂蛋白(HDL)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0197)、大鼠低密度脂蛋白(LDL)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0196)购自南京森贝伽生物科技有限公司；Anti-JNK1(phospho T183)抗体(货号：ab47337)、Anti-JNK1抗体[EPR140(2)](货号：ab110724)、Anti-β-catenin抗体(货号：ab16051)、Anti-GRP78 BiP抗体(货号：ab140318)、Anti-DDIT3抗体[9C8](货号：ab11419)、Anti-STAT3抗体[9D8](货号：ab119352)和Anti-XBP1抗体(货号：ab37151)购自Abcam。

可见紫外分光光度计，上海尤尼柯公司(型号：WFZ UV-2100)；低温高速离心机，德国Eppendorf公司(型号：5430R)；600 V电泳仪，美国GE Healthcare公司(型号：EPS601)；SDS-PAGE电泳槽，北京六一公司(型号：DYCZ-24DN)；qPCR扩增仪，美国ABI公司(型号：ABI 7500)；病理切片机，上海徕卡仪器有限公司(型号：RM2016)；倒置荧光显微镜，日本Nikon公司(型号：Nikon Eclipse Ti-SR)。

1.3 实验方法

1.3.1 肝细胞脂肪变性模型建立

用油酸和棕榈酸诱导HepG2细胞积累甘油三酯[12]。将油酸和棕榈酸(OA∶PA=2∶1，摩尔比)混合后置于90°C以上水浴中加热并不断摇晃，5 ～ 10 min左右可完全溶解，趁热移入DMEM完全培养基中，使油酸和棕榈酸的终浓度为0.33 mol/L和0.17 mol/L。HepG2接种于孔板中，孵育过夜后，用DMEM低糖培养基进行细胞饥饿12 h，然后换成含0.5 mol/L NEFA的DMEM完全培养基培养24 h诱导HepG2细胞脂肪变性。

1.3.2 Western blot实验

用混合脂肪酸诱导HepG2细胞脂肪变性后，加入生理盐水和不同浓度的泽泻提取物处理24 h后，收集细胞，含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30 min得到蛋白样品。BCA法测定总蛋白含量。100℃金属浴变性10 min后，加入loading buffer上样，跑电泳，转膜后，5%牛奶封闭，按说明书比例加入一抗及二抗，加入底物，化学发光仪器上观察条带并计算灰度值。

1.3.3 非酒精性脂肪肝动物模型建立

SD大鼠喂以高脂饲料(10%猪油+ 2%胆固醇+ 88%标准饲料)及饮水[13]，连续喂食8周。4只一组，分成四组，包括生理盐水对照组及泽泻提取物处理组(设置400、200、100 mg/kg泽泻提取物分别为高、中、低剂量给药组)。以灌胃方式给予药物治疗，每日2次，持续4周。对照组灌以生理盐水。油红染色阳性即为建模成功。

1.3.4 大鼠血清及肝组织采集

给药4周后，全体大鼠连续禁食12 h。称量体重，然后以1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取新鲜血液10 mL，4℃、3000 r/min离心5 min，取上清用于ELISA法生化指标测定；取血后，迅速解剖取得肝脏，PBS冲洗干净血液后，置于含20倍体积TRIzol溶液的EP管中，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于总RNA提取、基因表达分析。

1.3.5 血清生化指标检测

采集血清按照试剂盒说明书进行含量测定。

1.3.6 RT-PCR实验

解剖所得肝组织加入20倍体积的TRIzol溶液并研磨。提取RNA后，按照反转录试剂盒步骤反转录为cDNA，并进行RT-PCR实验。

1.3.7 油红染色

解剖所得肝组织在OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋后冰冻切片机切成15 μm的切片后，油红染色判断脂肪染色面积。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。定量结果采用多个样本油红染色面积为准，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P< 0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 油红O染色判断脂肪肝模型

高脂饮食诱发非酒精性脂肪肝模型组织中脂肪含量增高，肝细胞排列不规则，细胞内脂滴多为大泡，多囊泡型，油红O染色后，脂肪滴多呈片分布，水溶性封片剂封片后，脂滴常汇集在切片表面(见图1)。

注：a：生理盐水对照组；b：高脂饮食模型组；c：油红染色相对染色面积定量结果。与对照组比较，**P< 0.01。图1 油红染色判断脂肪肝模型(× 100)Note. a: Physiological saline control group; b: High-fat diet model group. c: Relative quantitative results of oil red staining. Compared with the control group,** P< 0.01.Figure 1 Evaluation of fatty liver model by oil red staining

2.2 Western blot检测内质网应激标记蛋白水平

作为内质网应激的经典标记分子，当细胞发生内质网应激时会上调GRP78表达并且通过活化CHOP、JNK、caspase-12等通路诱导凋亡发生[14-15]。IRE-1/XBP-1信号通路是高度保守的内质网应激通路，内质网应激通过酶剪切作用活化XBP-1，后者的活化导致内质网伴侣分子表达增加[16-17]。内质网应激可以通过抑制FAK-STAT3通路引发线粒体功能紊乱[17]。如图2 ～ 3所示，泽泻提取物处理后，JNK1、p-JNK1、GRP78、CHOP和XBP-1表达水平明显下降(P< 0.01)，STAT3表达增加(P< 0.01)，并且呈剂量依赖性。实验结果说明泽泻提取物可以抑制混合脂肪酸诱导HepG2细胞脂肪变性导致的内质网应激。

注：a：各组p-JNK1、JNK1、STAT3表达水平；b：各组STAT3表达定量结果；c：各组JNK1表达定量结果；d：各组p-JNK1表达定量结果。对照组：0 mg/kg AOE；低剂量组：100 mg/kg AOE；中剂量组：200 mg/kg AOE；高剂量组：400 mg/kg AOE。与高剂量组比较，* P < 0.05，** P < 0.01。图3、6、7同。图2 AOE处理后p-JNK1、JNK1、STAT3表达水平Note. a: Expression of p-JNK1,JNK1 and STAT3 in each group. b: Quantitative results of STAT3 expression in each group. c: Quantitative results of JNK1 expression in each group. d: Quantitative results of p-JNK1 expression in each group. Control group: 0 mg/kg AOE; low-dose group: 100 mg/kg AOE; moderate-dose group: 200 mg/kg AOE; high-dose group: 400 mg/kg AOE. Compared with the high-dose group,* P < 0.05,** P < 0.01. The same in Figures 3, 6 and 7.Figure 2 Expression levels of p-JNK1,JNK1 and STAT3 after AOE treatment

注：a：各组GRP78、XBP-1、CHOP表达水平；b：各组GRP78表达定量结果；c：各组CHOP表达定量结果；d：各组XBP-1表达定量结果。图3 AOE处理后GRP78、XBP-1、CHOP表达水平Note. a: Expression of GRP78，XBP-1 and CHOP in each group. b: Quantitative results of GRP78 expression in each group. c: Quantitative results of CHOP expression in each group. d: Quantitative results of XBP-1 expression in each group.Figure 3 Expression levels of GRP78,XBP-1 and CHOP after AOE treatment

2.3 透射电镜结果

混合脂肪酸作用于HepG2细胞后会导致细胞发生脂滴蓄积、空泡化等脂肪变性[19]。如图4所示，经过泽泻提取物处理，脂肪变性HepG2细胞中脂滴减少。

注：a：HepG2泽泻高剂量组(400 mg/kg AOE)；b：HepG2脂肪性病变组。箭头指示肝细胞脂变。图4 HepG2透射电镜照片(× 3500)Note. a: HepG2 in the high-dose group (400 mg/kg AOE); b: HepG2 in the fatty degeneration group. Arrows indicate fatty degeneration of the liver cells.Figure 4 Transmission electron microscopy of HepG2

2.4 泽泻提取物对SD大鼠肝脂肪性病变的影响

重度脂肪肝组织中脂肪含量高，肝脏组织细胞肿胀变形，通过高、中、低剂量的泽泻治疗后，从图5中显示，随着药物剂量浓度的增加，肝脏脂肪性病变随之好转。

注：a：生理盐水对照组；b：泽泻提取物100 mg/kg处理组；c：泽泻提取物200 mg/kg处理组；d：泽泻提取物400 mg/kg处理组。图5 油红染色检测泽泻提取物对SD大鼠肝脂肪性病变的影响(× 100)Note. a: Physiological saline control group; b: 100 mg/kg of AOE treatment group; c: 200 mg/kg of AOE treatment group; d: 400 mg/kg of AOE treatment group.Figure 5 Effect of AOE on hepatic steatosis of SD rats detected by oil red staining

2.5 ELISA结果

脂肪蓄积发生在非酒精性脂肪肝早期病程中。脂肪蓄积导致肝细胞内质网应激、线粒体应激反应及自噬受损等脂毒性，以及TG、VLDL水平降低[20]。AST、ALT作为肝功能评价指标，其升高预示着肝损伤。非酒精性脂肪肝患者由于肝脂肪代谢紊乱会出现血清HDL降低和LDL升高[21-23]。如图6结果所示，泽泻提取物处理后，大鼠血清中AST、ALT、TG、LDL的表达水平呈剂量依赖性下降(P< 0.01)，SOD、HDL表达升高(P< 0.01)。结果表明，泽泻提取物对非酒精性脂肪肝肝损伤具有治疗作用。

注：a：ALT检测水平；b：AST检测水平；c：SOD检测水平；d：TG检测水平；e：HDL检测水平；f：LDL检测水平。图6 ELISA检测血清生化指标Note. a: ALT detection level. b: AST detection level. c: SOD detection level. d: TG detection level. e: HDL detection level. f: LDL detection level.Figure 6 ELISA detection of serum biochemical indicators

2.6 RT-PCR结果

非酒精性脂肪肝会导致CYP2E1、CYP2A5上调表达[24-25]。如图7结果显示，泽泻提取物处理后，肝组织内CYP2E1、CYP2A5基因表达水平明显下降(P< 0.01)，尤其是高剂量组。

注：a：CYP2E1基因表达水平；b：CYP2A5基因表达水平。图7 RT-PCR检测CYP2E1、CYP2A5基因表达水平Note. a: CYP2E1 gene expression level. b: CYP2A5 gene expression level.Figure 7 RT-PCR detection of CYP2E1 and CYP2A5 gene expression levels

3 讨论

近年来，因生活方式改变、营养过剩等，非酒精性脂肪肝的发病率呈逐年上升的趋势[26]。30%的脂肪肝患者如果得不到有效治疗会逐渐进展成非酒精性脂肪性肝炎；如果病情继续进展，25%的非酒精性脂肪性肝炎可能发展成肝硬化或终末期肝病[27]，对人类健康造成严重威胁。

临床研究资料表明，痰瘀互结为非酒精性脂肪肝(NAFLD)的重要发病机制。丹参具有活血祛瘀之功，泽泻功能除水湿、消痰浊，两药为中医临床治疗NAFLD过程中使用频率较高的中药[28]。三萜类成分是泽泻中的主要成分之一，在泽泻的功效中起着非常重要的作用[29]。除了有效成分的确定，不同研究者从不同角度对其作用机制进行了探索性研究。

李金海[30]通过对应用异功泽泻汤治疗的52例非酒精性脂肪性肝炎患者及水飞蓟宾胶囊治疗的48例患者进行对照观察，发现异功泽泻汤在降低血脂、改善肝功能等方面均优于水飞蓟宾胶囊，泽泻可抑制外源性TG、TC的吸收，影响内源性TC代谢及抑制TG肝内合成，从而改善肝脏的脂肪代谢。王磊[31]通过对34例使用泽泻饮合京三棱丸治疗的非酒精性脂肪肝进行研究发现泽泻饮合京三棱丸能有效改善TC、TG的水平，治疗脂肪肝临床疗效显著。姜国贤等[32]报道了32例口服调肝降脂(青蒿、柴胡、山楂、茯苓、泽泻、法半夏、白芍、肉豆蔻、韭菜汁等)中药治疗非酒精性脂肪肝的临床研究结果，发现泽泻通过抑制外源性甘油三酯在肝内的合成，影响与胆固醇代谢有关的酶及抑制肝内甘油三酯合成等药理作用而发挥抗脂肪肝效果。

随后，又有不同的研究者从不同方面对泽泻护肝功能进行了研究。唐外姣[33]报道了护肝清脂片(由泽泻、山楂、三七、蒲黄、荷叶及陈皮六味中药组成)通过上调大鼠肝脏中沉默信息因子SIRT1的mRNA及其蛋白的表达，可以显著改善胰岛素抵抗，同时减缓氧化应激/脂质过氧化损伤，抑制肝脏胶原沉积，有效调节血脂代谢紊乱以及抑制肝脏脂质沉积。Park等[34]报道了泽泻乙醇提取物可以通过下调C/EBPβ表达，降低PPARγ和C/EBPβ表达水平来抑制OP9细胞脂肪分化。Jang等[35]报道了泽泻块茎甲醇提取物(MEAO)可以通过抑制肝脂肪生成基因、VLDLR等基因表达，增加ApoB分泌来减弱肝细胞内质网应激，阻止肝细胞病理性脂肪变性。曾璐[36]研究发现泽泻醇A-24-醋酸酯能逆转肝脂肪变性HepG2细胞的TNF-α和IL-6水平的增加。郭雨雅[37]报道了加味泽泻汤对可能通过抑制TLR4/NF-κB、MAPK信号通路上MyD88、NF-κB、P65、p-P65、P38、p-P38、MAPK蛋白的表达，抑制肝脏炎症的产生、缓解肝脏的损伤，对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD模型有良好的治疗效果。杜金梁等[38]报道了泽泻提取物对油酸诱导建鲤脂肪肝细胞损伤中生化指标及CYP1A蛋白表达的影响。孙晓琦[39]报道了加味泽泻汤可能通过改变NAFLD小鼠肠道微生物组成、改善肠粘膜屏障、降低肝脏内炎症因子表达及减轻肝脏炎症来发挥作用。

其它关于非酒精性脂肪肝的治疗机制研究也有很多，对泽泻治疗NAFLD的药理作用机制研究有很大的参考意义。田卫东[40]报道了阿托伐他汀能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠非酒精性脂肪肝肝脏损伤。郑培永等[41]报道了强肝胶囊和辛伐他汀可能通过改善瘦素抵抗，增加肝脏瘦索受体mRNA表达及P-JAK2和P-STAT3蛋白水平而对NAFLD大鼠肝脏脂质和炎症有较好的治疗作用。孙立云[42]报道了2 mmol/L DL-乙硫氨酸作用奶牛原代肝细胞24 h可成功制备脂肪变性肝细胞模型，10 μg/mL泽泻作用48 h，可以降低肝细胞CYP450的表达，对脂肪变性肝细胞具有较好的保护作用。杨文强等[43]报道了脂肪乳灌胃可以通过上调Wnt3α、β-catenin、Collal mRNA表达诱导非酒精性脂肪肝大鼠肝纤维化。关丽嫦等[44]报道了高脂饮食可以通过诱导肝组织JNK1、p-JNK1蛋白表达水平升高，激活肝细胞内JNK信号通路同时抑制了脂联素的生成，进而产生和加重NAFLD。

这些研究都为泽泻治疗NAFLD作用机制探索提供了重要依据，但是仍然没有泽泻作用机制的系统性研究。本文系统性地研究阐明了泽泻对非酒精性脂肪肝的治疗机制。但是本研究仍然存在不足，需要进一步实验来验证泽泻对肝细胞脂肪蓄积的缓解作用及其机制，因为脂肪蓄积是肝损伤的根本原因。总之，本文通过研究不同浓度泽泻对非酒精性脂肪肝血清生化指标、JNK信号通路及脂肪变性肝细胞内质网应激的影响系统地研究了泽泻治疗NAFLD的作用机制，为泽泻临床治疗NAFLD提供了重要理论依据。