尾静脉注射HL60、HL60/ADR细胞建立SCID beige小鼠白血病动物模型的研究

张 坤，徐昊淼，程 涓，赵 勇，许亚梅*

(1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700； 2.中国科学院动物所，北京 100101)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干祖细胞恶性克隆的疾病，表现为原始细胞的分化障碍和恶性增殖。白血病细胞多药耐药(multidrug resistance，MDR)是化疗失败的主要原因，耐药蛋白可在多种细胞内高表达[1-2]，MDR细胞具有很强的抗凋亡特性，因此寻求能抑制耐药蛋白表达及诱导MDR细胞凋亡的新药是目前研究的热点之一[3-4]。动物模型是新药探索、筛选评价的重要基础。本研究应用急性早幼粒细胞HL60及耐阿霉素(adriamycin，ADR)细胞HL60/ADR，构建稳定、有效、重复性好的急性髓系白血病模型，模拟临床白血病累及骨髓和全身播散的特点，为研究人类白血病耐药机制及药物治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级雌性SCID beige小鼠15只，体重(15.98±0.57) g，4 ～ 5周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK (京) 2017-0022]。饲养于中国科学院动物研究所屏障环境动物房[SYXK (京) 2013-0015]，含复合维生素B的标准颗粒饲料、饮水、垫料及一切与鼠接触的物品经灭菌处理，动物实验室温度保持在25℃左右，相对湿度保持在40% ～ 70%，每日光照12 h，适应性饲养一周。实验方案通过北京中医药大学东直门医院实验动物管理和使用委员会(IACUC)审批(2015-68)。

1.1.2 实验细胞株

HL60、HL60/ADR细胞株自中国医学科学院血液病研究所购入，接种于10 cm细胞培养皿，以含10%血清的培养基于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养箱中培养，每2 ～ 3 d传代，HL60/ADR在含阿霉素0.5 μg/mL的10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中维持耐药，实验前一周撤药。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI-1640培养基(北京利维宁生物科技有限公司)，DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(天津康源生物技术有限公司)，青霉素和链霉素各100 U/mL(Sigma)，anti-human CD13-PE、anti-human CD33-FITC(Thermo Fisher)。CO2培养箱(德国Heraeus公司)，台式冷冻离心机(美国Thermo Scientific，型号Sorvall Legend RT)，X-ray生物学辐照仪(RS-2000 PRO Biological System)、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号Epics XL)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及HL60、HL60/ADR细胞移植

将15只SCID beige小鼠随机分为对照组3只、四组模型12只(每组3只)。移植前24 h内均照射2GyX射线，模型组分别经尾静脉接种对数生长期HL60细胞悬液1 × 107个/只(M1组)、5 × 106个/只(M2组)，HL60/ADR细胞悬液1 × 107个/只(M3组)、5 × 106个/只(M4组)，对照组鼠尾静脉注射等剂量生理盐水。实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.3.2 SCID beige小鼠发病情况观察

观察SCID beige小鼠发病情况及生存期，测量实验动物体重变化情况。

1.3.3 SCID beige小鼠外周血常规及血涂片检测

照射前和接种后第10、18、28天分别经尾静脉取80 μL外周血，置于EDTA抗凝管中，送至北京中医药大学东直门医院检验科测定外周血中白细胞(white blood cell，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)含量和血小板(platelet，PLT)。同时取外周血吉姆萨-瑞氏染色后，油镜下观察细胞形态，每片计数100个细胞，计算白血病细胞的比例。

1.3.4 检测CD13、CD33表达情况

CD13、CD33是髓系细胞表面分化抗原，特别是在分化早期阶段[5]，故应用流式细胞技术检测外周血中CD13、CD33表达，并采用人源anti-human CD13-PE、anti-human CD33-FITC进行标记检测HL60细胞[6]。照射前和接种后第10、18、28天分别经尾静脉取50 μL外周血，加入2 μL肝素抗凝，加入1.8 mL二蒸水低渗裂解红细胞及血小板20 s后，加入0.2 mL MPBS终止反应，离心后弃去上清，每个样本加5 μL CD13-PE、CD33-FITC，混匀，37℃避光孵育30 min后，上流式细胞仪测定CD13、CD33细胞比例。

1.3.5 SCID beige小鼠骨髓细胞学检查

于濒死前断髓，剥离股骨、胫骨，放入平皿，剪去骨骺两端，并用1 mL注射器吸取PBS缓冲液冲洗股骨骨干，冲出骨髓细胞，冲3 ～ 4次，用注射器吸取骨髓液，慢慢将骨髓液经滤网注入离心管中，去除残渣，1700 r/min离心5 min，倒上清，加入1 mL红细胞裂解液(25 s)，再加PBS至10 mL，1700 r/min离心5 min，倒掉上清，最后得到的白色沉淀为骨髓细胞，加入50 μL胎牛血清反复吹打重悬，进行骨髓细胞涂片细胞学检查。

1.3.6 小鼠组织病理检查

第32天或濒死前处死小鼠，取其脾、肝、肾等脏器及肉眼可见瘤块，脾称重，并将取出的脏器及瘤块于4%甲醛固定24 h，然后进行常规石蜡包埋切片，切片厚度为2 μm，行HE染色，并在显微镜下观察白血病细胞浸润。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 SCID beige小鼠的生存状态观察

模型M1、M3组接种细胞7 d后，开始出现竖毛、萎靡少动等表现，随着时间的延长，逐渐出现脊背弓起、步态不稳、偏侧或转圈，模型M2、M4组在接种细胞10 d后出现上述症状(图1)。M1组分别于接种28 d、29 d各死亡1只，M3组于接种29 d死亡1只。至观察周期32 d，M1、M3组生存率分别为33%、67%，M2、M4组全部生存(图2)。

注：A：接种28 d模型组小鼠瘦弱、萎靡；B：濒死前小鼠状态。图1 SCID beige小鼠经尾静脉接种细胞后生存状态Note. A: Emaciated and flagging appearance of model groups at day 28. B: Agonal living state of the mouse.Figure 1 Living state of SCID beige mice after inoculation

图2 造模各组小鼠生存曲线Figure 2 Survival curves of the four model groups

四组模型鼠、对照组鼠经X线照射后7 d内体重均下降，各模型组体重随着时间的推移逐渐下降，接种第28天较第0天体重明显降低，M1、M3两组下降更为显著，均低于对照组(P< 0.05)。

2.2 血常规检测及外周血细胞形态变化

各组小鼠经X线照射7 d内白细胞迅速降低，随时间推移，逐渐上升，第28天各模型组白细胞计数均显著高于对照组，各模型组间差异无显著性，见表2；经X线照射SCID beige小鼠的血红蛋白含量下降，对照组第18天时恢复至一般水平，第28天M1、M3模型组血红蛋白含量均明显低于对照组，且M3组下降最为显著，见表3；照射后各组小鼠血小板计数一过性迅速减少，随时间推移，均逐渐回升，M2组小鼠血小板回升最明显，较其他组别明显增多，见表4。

表1 SCID beige小鼠各组体重变化Table 1 Changes in body weights of SCID beige mice in the five groups

注：M1组：接种HL60细胞1 × 107个/只；M2组：接种HL60细胞5 × 106个/只；M3组：接种HL60/ADR细胞1 × 107个/只；M4组：接种HL60/ADR细胞5 × 106个/只。下表同。与第0天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. M1 group: inoculated with 1 × 107HL60 cells per mouse; M2 group: inoculated with 5 × 106HL60 cells per mouse; M3 group: inoculated with 1 × 107HL60/ADR cells per mouse; M4 group: inoculated with 5 × 106HL60/ADR cells per mouse. The same in the following tables. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2 SCID beige小鼠各组外周血白细胞数变化Table 2 Changes in numbers of while blood cells in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：与第0天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 SCID beige小鼠各组外周血血红蛋白含量变化Table 3 Changes in hemoglobin levels in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：与第0天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

镜下HL60、HL60/ADR细胞多呈圆形或椭圆形，细胞核大而圆，占3/4面积以上，细胞质量少为深蓝色(HL60、HL60/ADR细胞形态见图3，模型组外周血涂片见图4)。每只接种1 × 107个细胞的M1、M3组小鼠外周血涂片中第10天开始偶见白血病细胞，M2、M4两组则于接种第18天观察到白血病细胞，由于SCID beige小鼠的T、B淋巴细胞功能缺失，并具备beige小鼠典型的自然杀伤细胞(natural killing cells，NK)功能缺陷，且经过X线2Gy预处理后，骨髓造血功能受到明显抑制，外周血涂片中少见有核细胞，白血病细胞比例难以统计，第21天时每片可计数100个细胞，M1组白血病细胞比例最高，至第28天时造模四组外周血白血病细胞比例均明显增多，M3组最为显著，见表5。对照组外周血涂片始终未见白血病细胞。

表4 SCID beige小鼠各组外周血血小板计数变化Table 4 Changes in numbers of platelets in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：与第0天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A：HL60细胞形态；B：HL60/ADR细胞形态。图3 细胞形态(吉姆萨-瑞氏染色，× 1000)Note. A: HL60 cell morphology. B: HL60/ADR cell morphology.Figure 3 Cell morphology. Wright Giemsa staining

注：A：接种HL60小鼠外周血白血病细胞形态；B：接种HL60/ADR小鼠外周血白血病细胞形态。图4 模型组小鼠外周血白血病细胞形态(吉姆萨-瑞氏染色，× 1000)Note. A: Leukemic cell morphology in peripheral blood after HL60 cell inoculation. B: Leukemic cell morphology in peripheral blood after HL60/ADR cell inoculation.Figure 4 Leukemic cell morphology in peripheral blood. Wright Giemsa staining

时间(d)Days白血病细胞比例Proportion of leukemia cellsM1组M1 groupM2组M2 groupM3组M3 groupM4组M4 groupP值P-value215.47±0.874.33±0.763.83±0.953.60±0.460.0752814.34±1.63*12.68±0.53**15.41±0.89**12.64±0.56**0.025

注：与第21天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained at 21 days after inoculation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表6 SCID beige小鼠各组外周血CD33阳性细胞比例变化Table 6 Changes in the rates of CD33-positive cells in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：与第0天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

表7 SCID beige小鼠各组外周血CD13阳性细胞比例变化Table 7 Changes in the rates of CD13-positive cells in peripheral blood of SCID beige mice in the five groups

注：与第0天比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with data obtained before X-ray irradiation,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3 外周血CD13、CD33表达变化

各模型组小鼠的CD33表达均逐渐增多，第28天时CD33阳性细胞比例显著高于对照组，然各模型组间差异无显著性，与其尾静脉接种细胞数量无相关性，见表6。接种HL60/ADR细胞后第10天、第18天M3、M4组CD13的表达一度显著增加，而第28天各组CD13阳性细胞比例差异亦无显著性，见表6。

2.4 小鼠骨髓细胞学形态

于第32天或濒死前处死小鼠，收集骨髓细胞并涂片，经瑞氏染色油镜下观察，因随实验进程，小鼠极度消瘦，生存状态极差，处死取材时未能吹出骨髓细胞，未能得到有效制片，考虑可能与小鼠骨髓坏死相关。

2.5 小鼠脏器组织病理学观察结果

各模型组小鼠脾正常组织结构均完全被破坏，呈现弥漫性异型性多核肿瘤细胞浸润，多核、核仁清，为白血病细胞浸润灶；肝小叶结构存在，肝细胞大量脂肪变、气球样变、点状坏死，偶见白血病细胞浸润，巨噬细胞可见(图5)；肾组织结构基本正常，未见白血病细胞浸润。

注：A：M1组脾(× 200)；B：M3组脾(× 200)；C：M1组肝(× 200)；D：M3组肝(× 200)；E：M1组脾(× 400)；F：M3组脾(× 400)；G：M1组肝(× 400)；H：M3组肝(× 400)。图5 模型组小鼠组织病理形态(HE染色)Note. A: Spleen of the mice in the M1 group (× 200). B: Spleen of the mice in the M3 group (× 200). C: Liver of the mice in the M1 group (× 200). D: Liver of the mice in the M3 group (× 200). E: Spleen of the mice in the M1 group (× 400). F: Spleen of the mice in the M3 group (× 400). G: Liver of the mice in the M1 group (× 400). H: Liver of the mice in the M3 group (× 400).Figure 5 Pathomorphological tissue features of the four model groups. HE staining

3 讨论

SCID beige小鼠经X线预处理后，每只尾静脉注射1 × 107个或5 × 106个HL60、HL60/ADR细胞均可构建急性髓系白血病动物模型，符合急性髓系白血病的生物学特点，高浓度成瘤更快，但生存期短，中位生存期约29 d。

前期实验中曾应用HL60细胞及BALB/c-nu/nu裸鼠构建模型，其中半数经2GyX线照射预处理，另半数未作处理，每只均经尾静脉注射1 × 107个对数生长期HL60细胞，经鉴定均未成瘤，接种小鼠均生存，外周血涂片及流式检测未检出白血病细胞，提示存在不同种属间体内免疫机制排异反应激活[7]。有研究显示，BALB/c-nu/nu裸鼠可经脾切除术，环磷酰胺腹腔注射及全身亚致死量辐射预处理后，经尾静脉注射对数生长期的人源细胞系，可成功构建白血病模型[8]。后于实验中应用环磷酰胺1 mg/10 g体重腹腔注射BALB/c-nu/nu裸鼠3 d，又经X线照射后进行静脉接种白血病细胞，实验小鼠于接种细胞第3天开始死亡，至第5天全部死亡。

白血病细胞大都是NK细胞敏感性的，在不同种属的裸鼠体内较难形成全身系统的白血病模型，多数仅能皮下成瘤[9]。BALB/c裸鼠为先天无胸腺鼠，缺乏T细胞免疫功能，但具有B淋巴细胞及NK细胞活性，且呈年龄依赖性[10]，而经强度较高的预处理后，经实验验证存活率极低。而SCID beige小鼠通过分别携带scid和beige常染色体隐性突变的C.B-17scid/scid小鼠和C57BL/6bg/bg小鼠杂交得到的同源系培育而来[11]。Beige基因突变小鼠降低体内NK细胞活性，并能有效改善C.B-17 SCID小鼠Leaky现象所造成使用上的缺陷，也较C.B-17 SCID小鼠成为更理想的细胞移植的接受者[12]。

目前建立白血病动物模型的方法主要有尾静脉注射、腹腔注射和皮下注射三种方法[13-15]。其中操作相对简单的皮下注射和腹腔注射，可使局部(皮下或腹腔)形成瘤块，且接种成功率高，但通过上述两种方式建立的模型与临床白血病患者的实际病情发展存在较大差距。故本研究为模拟临床白血病患者的实际病情发展特点，采用尾静脉注射细胞的方式建立模型，使白血病细胞可随血液循环形成全身性扩散及局部靶器官的浸润，能更好地模拟白血病累及骨髓和弥漫生长特点，以构建符合临床白血病病情特点的模型[16]。

本次研究利用2GyX线照射预处理，直接造成免疫系统损伤效应[17]，以破坏小鼠体内残存的免疫防御系统。现已知鼠源性肿瘤细胞的荷瘤鼠模型已较为成熟[18]，但毕竟鼠与人类之间存在种族差异，选用的SCID beige小鼠为建立人源性白血病模型提供了可能，根据既往的研究成果[19]，本研究中，经尾静脉分别接种了1 × 107个/只、5 × 106个/只两种不同浓度的HL60、HL60/ADR细胞株，通过接种前及接种后10 d、20 d、28 d对动物模型的形态学、分子免疫学和组织病理学检测，发现1 × 107个/只发病较5 × 106个/只更快，各实验组外周血白血病细胞比例均明显升高，组织病理学检查表明肝、脾脏器内均有不同程度的白血病细胞浸润。本次实验分别应用1 × 107个/只、5 × 106个/只细胞成功构建了人急性白血病小鼠模型，模型动物发病时间长，生存期稳定，与课题组既往造模结果一致[20]，为药物干预实验提供了良好的白血病动物模型，有重要的实用价值。