七氟醚对新生大鼠神经干细胞的增殖作用

黄剑峰，冼海燕，侯小琼

(1.广西医科大学第二附属医院手术麻醉科，南宁 530000； 2.广西医科大学基础医学院免疫学教研室，南宁 530021)

七氟醚因起效迅速，可控性好，气道刺激性小等优点，是目前儿科麻醉中应用最为广泛的吸入麻醉药。最近的研究表明常用的吸入全麻药暴露对中枢神经系统均有不同程度的毒害作用，婴幼儿大脑从孕中期开始至出生后的几年处于发育关键时期，容易受到外界不良因素的影响。研究表明长时间暴露于七氟醚会诱导发育期动物大脑神经细胞凋亡，影响神经系统发育，导致远期的学习认知功能障碍[1-4]。神经干细胞都具备分化成为神经元等神经系统各种不同细胞的潜能。内源性神经干细胞主要分布于脑室/脑室下区(ventricular/subventricular zone，VZ/SVZ)和海马齿状回的颗粒下层等部位，并且神经发生从发育期一直持续到成年[5]。目前大量研究主要集中在七氟醚对神经元的损伤作用和机制，但对神经元的前体神经干细胞的影响研究较少，本研究拟从神经干细胞增殖角度探讨七氟醚中枢神经系统毒性的发生及防治机制，为全麻药物神经毒性的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验选用初生7 d雄性SD大鼠48只，清洁级，体重15 ～ 20 g，购自广西医科大学实验动物中心[SCXK (桂) 2016-0054]。动物实验经由实验动物管理委员会批准(2016-0113)，在实验动物中心屏障动物实验设施进行[SYXK (桂) 2016-0037]，实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀照顾。

1.2 主要试剂与仪器

七氟醚(美国Baxter Healthcare公司)，BSA封闭液、显影定影试剂盒、TBST缓冲液、枸橼酸盐缓冲液(北京索莱宝生物技术有限公司)，Nestin、Cyclin D1、Smad4、BMP2单克隆抗体(美国Abcam公司)，β-actin、FITC绿色荧光二抗及DyLight 594红色荧光二抗(北京中杉金桥生物生物技术有限公司)，兔多抗BrdU(美国Accurate Chemical)。切片机(德国Leica CM1900)，荧光显微显微镜(日本Olympus BX61)，病理图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备及分组

将动物随机分为3组，每组16只，即对照组(Con组)、1%七氟醚组(S1组)、3%七氟醚组(S2组)。在麻醉气体挥发罐中加入适量液态七氟醚，将氧气罐的输出端连接至小动物麻醉机的入口处，麻醉机出口接至麻醉诱导箱中，温度控制在(37±2)℃。将动物放入麻醉诱导箱中，开通气阀，使氧气罐中的氧气携带挥发罐中的七氟醚进入麻醉诱导箱中，从而使动物麻醉。调整七氟醚的浓度，2 L/min流量，麻醉持续4 h。麻醉终止后6 h，处死大鼠，于冰上迅速离出大脑，切取额叶内含脑室区(VZ)和脑室下区(SVZ)的脑组织。

1.3.2 Nestin/BrdU双标检测神经干细胞增殖

采用免疫荧光染色法，鼠脑冷冻好后，将其在切片机内固定好，切片厚度20 μm，将贴好的脑片放于片盒内保存在-20℃内。脑片在TBS溶液中进行水化，放置于室温下15 min，吸干脑片周围的水分，加入鼠单抗Nestin(1∶200)和兔抗鼠BrdU(1∶200)混合，4℃过夜；弃掉一抗，PBS洗5 min。FITC标记的荧光二抗(1∶200)和DyLight 594红色的荧光二抗(1∶400)加到载玻片的组织上，室温孵育2 h，PBS清洗，用滤纸吸干组织周围水分，滴加一滴稀甘油，盖片。将制备好的玻片放置在荧光微镜400倍下观察，每组随机选取5个视野，双标Nestin/BrdU阳性细胞数与Nestin阳性细胞数目比值为神经干细胞增殖率(%)。

1.3.3 Western blot检测蛋白表达

蛋白裂解液处理各组样品，使用超声破碎仪低温裂解3次，每次30 s，离心(4℃，12 000 r/min，10 min)，取上清测定蛋白浓度，配平各组蛋白浓度，蛋白变性，经SDS-PAGE分离电泳后转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，Nestin(1∶500)、Cyclin D1(1∶1000)、Smad4(1∶1000)、BMP2(1∶500)4℃冰箱过夜，弃掉一抗，TBST洗膜5 min，3次；将膜转入杂交袋，室温孵育二抗(1∶10 000)2 h，弃掉二抗，TBST洗膜5 min，3次；ECL系统显影，采用Image-Pro Plus 6.0软件测定条带的灰度值，以目标蛋白与β-actin灰度值之比表示目标蛋白的表达水平，实验重复3次。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 七氟醚麻醉对Nestin蛋白表达的影响

Nestin蛋白表达，S1组(0.54±0.04)和S2组(0.43±0.06)均低于对照组(0.61±0.06)，其中S2组中Nestin蛋白表达与对照组相比差异有显著性(P< 0.05)。结果见图1。

图1 七氟醚麻醉对新生鼠脑组织Nestin蛋白表达影响(n=6)Figure 1 Effects of sevoflurane anesthesia on protein expression of Nestin in the brain of neonatal rats

2.2 七氟醚麻醉降低的新生鼠神经干细胞增殖

对照组中Nestin/BrdU双阳性细胞数目所占Nestin阳性细胞百分比为(41.3±6.7)%，S1组和S2组双阳性细胞百分比分别为(25.6±7.2)%和(17.4±5.9)%。与对照组比较，S1组和S2组神经干细胞增殖率降低，差异均有显著性(P< 0.05)，结果见图2。

表1 七氟醚麻醉对新生鼠脑组织中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表达影响Table 1 Effects of sevoflurane on protein expression of Cyclin D1, Smad4, and BMP2 in brain tissue of neonatal rats

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：标尺=50 μm。图2 七氟醚对新生鼠神经干细胞增殖影响(n=6)Note. Bars=50 μm.Figure 2 Effects of sevoflurane on the proliferation of neonatal rat neural stem cells

2.3 七氟醚麻醉影响新生鼠脑组织中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表达

与对照组比较，S1组和S2组细胞内Cyclin D1的表达下调(P< 0.05)。与对照组比较，S1组和S2组Smad4和BMP2表达增高，差异均有显著性(P< 0.05)，结果见图3和表1。

图3 七氟醚对新生鼠脑组织中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表达影响(n=6)Figure 3 Effects of sevoflurane on protein expression of Cyclin D1, Smad4, and BMP2 in brain tissue of neonatal rats

3 讨论

七氟醚作为临床广泛使用的吸入麻醉药，对未成熟神经系统的损伤已引起广泛关注。已研究表明七氟醚麻醉出生7 d小鼠6 h，引起海马和前额皮质等多个脑区神经元调亡[6]。神经元是由神经干细胞分化而来，七氟醚麻醉对神经干细胞是否有不良作用，目前尚不清楚。胚胎时期许多部位都存在神经干细胞，终生存于VZ/SVZ区、海马齿状回、大脑皮层等部位。其高度自我更新能力，维持自身数目的稳定和干细胞的特性。Nestin作为神经干细胞的标记物，有调节神经细胞增殖，分化成熟作用，随着神经干细胞完成迁移和分化，Nestin表达逐渐减少甚至消失。通过Western blot检测不同组别Nestin表达情况发现，七氟醚处理后，Nestin表达出现下降趋势，说明内源性神经干细胞数量是减少的。

大脑发育处于未成熟阶段，容易受外界不良因素影响神经干自我更新、增殖和分化能力。如果干细胞在本该保留增殖能力的阶段脱离了细胞周期，就会没有足够的神经干细胞产生新的神经元维持神经发育的后期阶段，导致神经发生的异常[7]。BrdU常用于标记活细胞中新合成的DNA，随着DNA复制进入子细胞中，判断细胞的增殖能力。BrdU与Nesin双标检测神经干细胞增殖率发现，S1组和S2组VZ区和SVZ区神经干细胞增殖率低于对照组，这与以往的研究类似[8]。以上结果说明，七氟醚对新生鼠神经干自我更新的能力具有干预作用。研究中发现，对照组的Nestin阳性细胞主要集中在VZ区和紧邻该区的SVZ区，S1组Nestin阳性细胞减少主要是在VZ区，在SVZ区并无明显减少，且Nestin阳性细胞还有向SVZ区远端扩展趋势；S2组Nestin阳性细胞减少也主要是在VZ区，以及邻近VZ区的SVZ区，SVZ区远端仍保持较高的Nestin阳性细胞。目前仍不清楚为何出现此现象，尚需进一步研究。

Cyclin D1是细胞周期调控蛋白，Cyclin D1基因敲除，抑制了在体海马齿状回(dentate gyrus，DG)区和SVZ区神经干细胞的增殖，同时诱导神经干细胞走向凋亡[9-10]。Cyclin D1基因过表达可促进神经干细胞的增殖[11]。本研究结果表明，与对照组比较，S1组、S2组脑组织中Cyclin D1蛋白表达下调，提示七氟醚诱发增殖抑制的机制与下调脑组织Cyclin D1有关。

BMP2属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员，其信号通路参与神经干细胞增殖和分化的作用[12]。BMP2及其受体发挥作用主要通过Smad介导的转导途径实现[13-14]。在信号转导过程中，细胞外的BMP2与细胞膜表面的BMPRⅠ、BMPRⅡ结合形成复合物，BMPRⅡ磷酸化后，再激活BMPRⅠ而形成活化的复合物，然后引起Smad磷酸化而激活，活化的Smad发生构象改变，从受体上游离，与细胞质中的Smad1/4结合，共同转位入细胞核中，转录Cyclin D1，进而调节细胞的增殖与凋亡[12,15]。本实验结果中七氟醚处理后，BMP2和Smad4表达增强，而Cyclin D1表达降低，神经干细胞增殖率降低。已有报道全麻药物可抑制发育期大脑神经干细胞与神经元的増殖，神经细胞增殖减少可影响认知功能[16]，与本研究结果相似，推测此七氟醚可能影响了神经细胞的增殖。

综上所述，七氟醚麻醉新生大鼠导致VZ/SVZ区Nestin表达下降，干细胞增殖活性降低，该变化和脑内Cyclin D1信号下调、BMP2和Smad4水平上调有关。