广东省地区结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及耐药相关性

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结核病严重危害人类健康，是我国重点防控的重大疾病之一。近年来，人口流动的增加和耐药结核分枝杆菌的增多更加剧了结核病在人群间的传播，因此必须加强对结核病有效的控制和监测。分子流行病学，尤其是基因分型方法是监测结核病流行和传播的有效手段。

间隔区寡核苷酸分型法(spacer oligonucletide typing,spoligotyping)是一项用于鉴别结核分枝杆菌家族遗传的技术，由于其有可靠、高效等特点，因此被广泛采用，特别在北京家族菌株中[1-2]。目前，多个亚洲国家分离的结核分枝杆菌的基因分型结果表明，北京基因型是主要流行基因型[3]。此外，北京基因型在俄罗斯也是优势基因型[4]，但是，在芬兰、丹麦等北欧国家却很少发现[5]。而在我国南方，北京基因型的比例会有所降低，其它基因型例如T家族、Haarlem H3基因型、MANU家族菌株，U型及H型家族等菌株会有增多[6-8]。而在先前的报道中，北京基因型导致了耐多药结核病的暴发，一些研究推测，北京基因型与耐药性相关[1，9]。广东省是一个人口流动大省，结核病的疫情比较复杂，耐药情况比较严重，为了解广东地区各种基因型与耐药性的关系，作者收集广州市胸科医院的504株来自广东省各地区的结核分枝杆菌临床分离株，采用spoligotyping方法进行基因分型，比例法进行常规抗结核药耐药性检测，并对各基因型及耐药情况进行分析。

1 材料与方法

1.1菌株来源 随机数字表法从广州市胸科医院结核分枝杆菌菌株库中选取504株广东省不同地区近年在临床上分离的结核分枝杆菌菌株，包括广州市302株、东莞12株、佛山8株、河源14株、惠州6株、江门1株、揭阳24株、罗定3株、茂名13株、梅州8株、普宁1株、清远16株、汕头18株、潮汕1株、潮州2株、汕尾25株、韶关5株、深圳5株、阳江5株、云浮7株、湛江14株、漳州1株、肇庆4株、中山7株、珠海2株，经转种后备用。

1.2主要仪器与试剂 1)SAN96 熔解曲线检测仪、BACTEC MGIT 960系统、Lab-Aid 820核酸提取仪。2)结核分枝杆菌McSpoligotyping分型检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)、DNA提取液及 DNA提取磁珠条购于厦门致善生物科技公司；7H9培养药敏管购自BD公司。

1.3药敏及菌种鉴定方法 结核分枝杆菌参照《分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作程序》[10]进行药敏试验，异烟肼(Isoniazid,INH)、链霉素(Streptomycin,SM)、利福平(Rifampin，RFP)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide, PZA)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)、阿米卡星(Amikacin, AMK)药敏试验采用 MGIT 960 法，待仪器自动报告结果时，记录报阳时间并分析结果； 菌种鉴定方法采用晶芯基因芯片法。

1.4DNA提取 用接种环(22 SWG标准接种环)挑取一环(5-10 mg)在罗氏培养基上生长良好的结核分枝杆菌菌落于200μL DNA提取液中，涡旋震荡器震荡破碎，99 ℃灭菌20 min，采用磁珠法于核酸提取仪中提取DNA，-20 ℃保存备用。

1.5基因分型 采用熔解曲线间隔区寡核苷酸分型(Melting curve Spoligotyping， McSpoligotyping)法。结核分枝杆菌基因组序列设计荧光PCR引物序列，引物序列信息为DRa：5′-GGT TTT GGG GAC GAC-3′,DRb：5′-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3′。根据厦门致善结核分枝杆菌McSpoligotyping分型检测试剂盒使用说明，选择结核分枝杆菌所携带的43个特异的间隔区(Spacer)作为检测模型。首先，在高度同源的同向重复序列(DR, direct repeat)上设计一对通用引物，并利用这对通用引物扩增出间隔区(S1～S43)的PCR产物；其次，根据每个间隔区的DNA序列设计能够与之特异杂交的荧光探针。每条荧光探针都带有特征性的荧光标记和熔点温度组合。当PCR产物中存在某一间隔区序列时，相应的荧光探针就能与之杂交形成特征的熔解曲线峰；最后，通过这些熔解曲线峰的组成确认待检样品中所存在的间隔区，从而推断样品中所携带的结核分枝杆菌型别。其扩增、熔解曲线分析程序如下：95 ℃预热 5min→95 ℃解链 10S→57 ℃退火15S→76 ℃ 延伸10S，共50个循环→95 ℃ 3 min→35 ℃ 1 min，35 ℃ ∽90 ℃以0.04 ℃/S的升温速率进行熔解曲线分析，且此阶段采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光信号。

1.6质量控制 在结核分枝杆菌复合群GyrA基因的序列片段上设计一对扩增引物及相应的检测探针，作为体系的内控指示样品质量是否合格。采用标准菌株H37RV结核分枝杆菌及BCG分枝杆菌做质量控制菌株。

1.7统计学与分析 Mcspoligotyping 的基因分型数据交国际数据库MIRU-VNTRplus(http://www.miru-vntrplus.org)[11]和SpolDB4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITD_ONLINE)[12]。采用BioNumerics5.0进行聚类分析，不同基因型的构成比和耐药率运用SPSS19.0软件进行卡方检验等进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1广东省地区结核分枝杆菌的种类 504株经晶芯基因芯片鉴定证实为结核分枝杆菌采用Mcspoligotyping法分型，分为北京基因型和非北京基因型两大类，其中北京基因型菌株为386株，占76.6%，非北京基因型菌株118株，占23.4%。其中非北京基因型包括T家族48株，占9.5%(48/504)；H3家族11株，占2.2%(11/504)；EAI家族7株，占1.4%(7/504)；MANU家族6株，占1.2%(6/504)；LAM9 4株，占0.8%(4/504)；AMBIGO 4株，占0.8%(4/504)；CAS1-Delhi 1株，占0.2%(1/504);新发现基因型37株，占7.3%(37/504)。

2.2广东省地区主要寡核苷酸分型类型 对获得的寡核苷酸基因分型数据进一步分类，504株分离株共归属于77种不同寡核苷酸分型类型，其中49种在SPOIDB 4.0数据库中可以检索到，另外有28种属于新发现的寡核苷酸分型类型。通过使用BioNumerics 聚类分析，453株归类于30个簇中，成簇菌株比例为83.93%{(453-30)/504}。见图1。在成簇的30种基因型内，有79.76%(402/504)的分离株属于5种主要的流行簇，数据库的SIT编号为：SIT1(北京基因型)370株，占73.41%(370/504);SIT53(T1基因型)15株，占2.98%(15/504)；SIT52(T2基因型)7株，占1.39%(7/504)、SIT19(EAI2-Ma基因型)5株、SIT523(Manu-ar基因型)5株，分别占0.99%(5/504)。

图1 结核分枝杆菌寡核苷酸分型聚类图Tab.1 Mycobacterium tuberculosis oligonucleotide typing clusterogram

图2 广东省地级市504株结核分枝杆菌的北京基因型及非北京基因型分布图Fig.2 Beijing genotypes and non-Beijing genotypes of 504 strains of Mycobacterium tuberculosis in prefectural cities of Guangdong Province

2.3北京基因型的分布特征 省内各地级市的504株结核分枝杆菌北京基因型、非北京基因型的分布见图2。其中汕头、汕尾、揭阳、东莞四个地级市的北京基因型比例分别为：50.0%(9/18)、56.0%(14/25)、58.3%(14/24)和41.7%(5/12)，低于广州市的80.5%(243/302)，差异有统计学意义(χ2=7.7, 6.8，5.3和8.3,P<0.05)；河源、湛江、茂名、清远四个地级市的北京基因型比例分别为：57.1%(8/14)、85.7%(12/14)、76.9%(10/13)和93.8%(15/16)，与广州市的差异无统计学意义(χ2=3.1, 0.02，0.1和0.99,P>0.05);余下的地级市因分离菌株数少于10株不作统计。504株结核分枝杆菌临床分离株的患者，男性有356人，女性148人，北京基因型在性别的构成比分别为：74.16%(264/356)和82.43%(122/148),无统计学差异(χ2=3.54，P>0.05)。按年龄分段为青少年组(0―20岁)、青年组(21―60岁)、老年组(61―100岁)，北京基因型在上述年龄组的构成比分别为：80.4%(41/51)、76.9%(280/364)和73.0%(65/89),三者间无统计学差异(χ2=2.24,P>0.05)。

2.4北京基因型与耐药表型的关系 在本研究的504株结核分枝杆菌中有386株为北京基因型(76.6%)， 118株为非北京基因型(23.4%)，上述两大类基因型结核分枝杆菌的INH、SM、RFP、EMB、PZA、AMK、LVFX的耐药率及MDR、XDR的比率见图3。据统计，其中INH、PZA、AMK的耐药率差异有统计学意义(χ2=6.6, 6.7和4.0,P<0.05)，其余药物的耐药性无统计学差异(χ2=1.38,0.01,2.10,3.10,2.26,2.09,P>0.05)。在MDR和XDR菌株中，北京基因型的比例为82.1%(87/106)和90.0%(18/20)。北京家族对比于T家族、H3家族，EAI家族来说，耐药发生率高4.7%～40.2%，由于后三者家族的分离例数较少，无统计比较意义。 MANU与LAM9家族呈现一定抗结核药耐药性，耐药率接近于北京家族。EAI家族菌株耐药性最低，对以上7种抗结核药物均敏感(见图3)。

图3 结核分枝杆菌基因型各家族的耐药情况(株%)Fig.3 Resistance of Mycobacterium tuberculosis in each genotypes family(strain%)

2.5广东省主要流行株的耐药表型分析(图4) 选取主要的有代表性的5种基因型，对其进行耐药情况分析，耐药结果为以北京基因型SIT1作为对照，其它4种基因型的耐药表型与SIT1对比分析。数据显示SIT1基因型的INH、PFP、 SM、EMB、 PZA、 AMK、LVFX、MDR、XDR 的耐药率均高于SIT53(T1)、 SIT52(T2)、 SIT19 (EAI2-Ma)4.3%～26.0% ，而SIT523(MANU-_ar)在 RFP、SM、EMB、MDR的耐药率方面高于SIT1 13.8%～45.4%。由于SIT1以外的四种基因型例数太少，没有统计学比较意义。

图4 结核分枝杆菌5种基因型的耐药率(%)情况Fig.4 Resistance rate (%)of 5 genotypes of Mycobacterium tuberculosis

3 讨 论

结核病在世界范围内肆虐，其中发现北京基因型的传播与流行是其中一大原因，本研究数据显示：广东省部分地区的北京基因型分离率为76.6%，流行簇为SIT1，占73.41%，高于北印度、伊朗、南非、越南、泰国[13-17]，接近于西北俄罗斯[18]。相比于国内各省，高于云南、香港、台湾等南方地区[19-21],低于河南、西藏等西北地区[22-23]。北京家族基因型在东亚地区的大规模流行可能与其强毒力有关，同时也与该地区人群广泛接受卡介苗接种密切相关，有研究表明卡介苗接种产生的保护力无法保护人群对北京家族结核分枝杆菌菌株的感染，因此，对北京基因型深入的研究将提升我们对我国主要流行的基因型的理解。

本研究分离的非北京基因型菌株占23.4%，分别为T家族、H3家族、EAI家族、MANU家族、LAM9、AMBIGO、CAS1-Delhi 及新发现基因型，基因型呈多态性分布。T家族流行于中南美地区，EAI家族则主要分布于东南亚和南印度地区，MANU是北京家族菌株与欧美家族混合感染而成，LAM9是拉丁美洲地中海基因型，中国广东省是一个人口流动大省，与各国贸易旅游人口流动相关，例如广州部分地区就是外国人贸易的聚居区，其中有大量的外国人长期居住于此地从事商业贸易，特别是来自于非洲、南亚地区的人群较多，与上述地区频繁的人口流动可能导致在非洲、中亚、南亚流行的结核分枝杆菌在广东地区的播散。而潮汕人(汕头、汕尾、揭阳等地)现聚居海外的有一千多万人口，有“海内一个潮州，海外一个潮州”之说，东莞市地区海外华侨约30万，是著名的华侨之乡，上述地区在世界范围内的人口流动更为频繁，各国流行的结核菌基因型得到传播而至非北京基因型的比例在50%左右，基因型更具多态性分布特征。

不少文献认为北京基因型与耐药有相关性[24-25]， 本研究显示在INH、RFP、EMB、PZA、AMK、LVFX抗结核药以及MDR、XDR上，耐药率均高于非北京基因型，研究结果与逄宇相近[25]。其中高于T家族，H3家族，EAI家族。而MANU是北京家族菌株与欧美家族混合感染而成,耐药率与北京基因型相近。 LAM是拉丁美洲地中海的耐药基因型，与抗结核药物具有耐药相关性，与文献报道相近[26]。我们将本研究主要的5种基因型进行耐药性分析，发现SIT1北京基因型与抗一、二线结核药有耐药相关性同时高于SIT53(T1)，SIT52(T2)，SIT19(EAL)。而SIT523(Manu-ar)有耐药相关性。值得注意的是MDR-TB 和XDR-TB菌株中有82.1%和 90.0% 均为北京家族，由此可见北京家族是引起广东省耐多药结核和泛耐药结核病的主要基因型。

本研究首次采用新型的自动化基因分型方法对结核分枝杆菌菌株的基因型鉴定，于传统的手动spoligotyping方法相比较，这种方法的自动化程度高，有效减少了人为操作，另一方面，由于自动化的判读而非通过杂交后的人工判读，最大程度降低了传统spoligotyping方法对部分位点杂交非特异信号的误判，使得研究结果更科学。本研究中仅发现了7%的新基因型，显著低于之前的报道[24]，提示我们上述方法良好的应用前景，特别是对于条件有限的实验室，上述方法有着其更强的优势。

综上所述，经MCspoligotping分型，广东省部分地区结核分枝杆菌的基因型呈多态性，以北京基因型为主要。流行株为国际数据库SITVIT2编号为SIT1基因型.且与抗结核药物有耐药相关性，同时是MDR-TB和XDR-TB的主要流行株。对北京基因型结核分枝杆菌的传播与耐药机制应引起重视。