滇重楼种子检验规程研究△

李玛，苏钛，李云，陈明玮，邱斌，段丽*

(1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白药集团创新研发中心，云南 昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111)

种子是最基本的生产资料，是育苗生产的物质基础，开展中药材种子检验规程和质量研究，制定种子检验规程和种子质量标准，能够从源头上保证中药材质量的稳定可控[1]，是国家推进中药标准化的一项重要任务。与农作物种子标准化的进程相比，中药材的种子质量控制还非常落后，目前关于中药材种子质量标准控制的工作已逐步展开，诸如三七[2]、射干[3]、青蒿[4]、远志[5]等药材的种子质量检验方法已见报道。

滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensisHand-Mazz.是百合科重楼属多年生宿根性草本植物[6]，以干燥根及根茎入药，药材名重楼，它以重楼皂苷作为有效成分，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症[7]。随着市场对滇重楼药材需求的不断增加，野生资源已不能满足市场对滇重楼药材的需求，人工驯化种植工作正在逐步开展。滇重楼的主要繁殖方式有切块繁殖和种子繁殖，对比两种繁殖方式，切块繁殖大量消耗药材，且繁殖率低，而种子繁殖率高，可大规模提供种苗，能够满足当下滇重楼种植产业对种苗的需求。近年来对滇重楼的研究主要集中于化学成分的分析与测定、药理作用、栽培繁育[8]方面，但对关乎种子质量的种子检验方法尚未见报道。因此，本研究对滇重楼种子的净度、千粒重、真实性鉴定、含水量、生活力的检测方法以及发芽条件进行系统的研究，以期为制定滇重楼种子检验规程和质量分级标准提供依据。

1 材料

滇重楼种子收集于云南省红河州和文山州各滇重楼栽培区，经中科院昆明植物研究所李恒研究员鉴定为百合科重楼属植物滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的种子。

2 方法

2.1 扦样

2.1.1 种子批 根据滇重楼种子的市场流通情况和送验要求，确定滇重楼种子批的最大质量和送验样品的最小质量。

2.1.2 扦取送验样品和试验样品 按GB/T 3543.2-1995《农作物种子检验规程扦样》的规定执行。样品扦取后，干净纸袋包装，在室内阴凉干燥处保存。

2.2 净度分析

按GB/T 3543.3-1995《农作物种子检验规程净度分析》的规定执行。四分法从送验样品中扦取试验样品，并将其分成净种子、其他植物种子和杂质3种成分，测定各成分的重量百分比，重复4次。

2.3 种子真实性鉴定

采用种子形态鉴定法。随机数取种子100粒，重复3次，逐粒对大小、形状、颜色和表面构造进行观察并记录。

2.4 千粒重测定

按GB/T 3543.7-1995《农作物种子检验规程其他项目检验》规定执行。分别采用百粒法、五百粒法、和千粒法进行测定。①百粒法：随机从净种子中数取100粒，重复8次，分别称重，计算平均值、标准差和变异系数，变异系数(CV)<4.0%，测定值有效；②五百粒法：随机从净种子中数取500粒，重复4次，分别称重，计算平均值、标准差和变异系数，变异系数(CV)<4.0%，测定值有效；③随机从净种子中数取1000粒，重复2次，分别称重，计算平均值和重复间差数与平均数之比，重复间差数与平均数之比小于5.0%，测定值有效。

2.5 含水量测定

采用烘干减重法测定滇重楼种子含水量。按GB/T 3543.6-1995《农作物种子检验规程水分测定》规定执行。将用于盛装样品的小铝盒预先烘干1 h(130～133 ℃)并置于硅胶干燥器中冷却备用。分别采用高恒温法和低恒温法对种子含水量进行测定。①低恒温法：分别在(103±2 ℃)低恒温条件下，设置1、2、3、4、5、6、7、8、17 h计算种子水分损失量；②高恒温法：分别在(131±2 ℃)高恒温条件下，设置1、2、3、4、5、6、7、8、9 h计算种子水分损失量。每个处理3次重复，每次重复(5±0.001)g。

2.6 生活力测定

采用红四氮唑(TTC)法测定种子生活力。

2.6.1 种子预处理 室温条件下，蒸馏水浸种12 h后，沿种脐纵切种子，取半粒备用。

2.6.2 染色条件的确定 取上述备好的种子进行试验：分别设置TTC溶液浓度为0.01%、0.05%、0.1%，染色时间为1、2、3、4、5、6、7、8 h，于30、35、40 ℃条件下对种子进行染色，每个处理3次重复，每个重复100粒种子。染色结束后，沥去溶液，冲洗3～5次，观察并计数。

2.6.3 滇重楼种子有无生活力标准建立 参照种子的发芽试验结果，建立滇重楼种子TTC染色的鉴定标准。

2.7 发芽率测定

2.7.1 发芽前处理 自来水(ck)、无菌水、0.1%高锰酸钾、1%次氯酸钠各浸种10 min后，ck和无菌水浸种处理组直接置床，其余2处理组无菌水冲洗3次后置床，采用纸上法，置于20 ℃培养箱中黑暗培养，观察种子污染率，每个处理50粒种子，3次重复。

2.7.2 适宜发芽床的确定 发芽床设3个处理：(1)纸上：培养皿中铺2层充分吸湿的滤纸，将预处理的种子均匀置床；(2)砂上：将拌好的含水量为20%的湿砂在培养皿内铺10 mm厚，种子均匀置床，(3)蛭石：将拌好的含水量为20%的蛭石在培养皿内铺10 mm厚，种子均匀置床，培养条件为20 ℃黑暗培养，每个处理50粒种子，3次重复，观察统计种子发芽情况。

2.7.3 适宜发芽温度的确定 发芽床为纸上，发芽温度设定为恒温15、20、25 ℃，黑暗下培养，每个处理50粒种子，3次重复，观察种子发芽情况。

2.7.4 光照对种子发芽的影响 以纸上为发芽床，于20 ℃恒温条件下进行光照(12 h光照，12 h黑暗)和24 h全黑暗处理，每个处理50粒种子，3次重复，观察种子发芽情况。

2.7.5 发芽计数时间确定 根据种子发芽表现，确定初次计数时间和末次计数时间。以胚根伸出种皮2 mm时的天数为初次计数时间，以种子发芽数达到最高时，以后再无发芽种子出现时的天数为末次计数时间。

2.7.6 结果统计 试验结果以发芽率表示：

(1)

3 结果与分析

3.1 扦样

滇重楼种子批的最大质量为2000 kg，净度分析试样是按至少含有2500粒种子推算而来，根据3.4结果，滇重楼种子千粒重为62.42 g，2500粒种子重量为187.26 g，所以确定滇重楼净度分析试样的最小重量为200 g，送验样品为净度分析的10倍以上，最少为2000 g。

3.2 净度分析

试验中滇重楼种子均由所收集的果实洗去果皮并阴干表面水分所得，试样均没有其他植物种子，亦无杂质，净度为100%。

3.3 真实性鉴定

滇重楼果实蒴果室背开裂，棕黄色；种子多数，种皮肉质多汁，樱红色，长：6.64～7.42 mm，宽：5.09～5.52 mm，厚：5.47～6.10 mm；除去假种皮后种子呈卵球形，种子坚硬，光滑，呈白色，长：4.85～5.97 mm，宽：3.75～4.65 mm，厚：3.53～4.65 mm；种子一侧有黄白色圆形种脐。

3.4 千粒重测定

随机选取经净度分析后的滇重楼种子试样进行测定，结果见表1。采用百粒法测定结果显示变异系数(CV)大于4.0%，所以百粒法不适用于滇重楼种子千粒重的测定；根据结果显示采用五百粒法及千粒法两种方法测定时，测定值均有效，鉴于500粒法所用种子数量较少，因此，滇重楼种子适宜的千粒重测定方法为五百粒法。

表1 滇重楼种子千粒重测定

3.5 含水量测定

滇重楼种子含水量测定结果见表2。高恒温烘干法中，1～6 h滇重楼种子水分不断失去，是快速失水期，失去自由水；6～7 h水分散失减慢，是缓慢失水的时期，7～9 h水分散失显著减慢，是较慢的失水期，失去分解水，失水量趋于稳定，烘干8 h与9 h之间无显著差异；低恒温烘干中，1～4 h滇重楼种子水分不断失去，是快速失水期，失去自由水；之后水分散失减慢，是缓慢失水的时期；烘干17 h后种子含水量与高恒温烘干8 h无显著差异。因此，使用高恒温烘干法烘干8 h测定滇重楼种子含水量。

表2 滇重楼种子水分测定

注：处理间多重比较采用LSD法，差异显著性分析取P= 0.05水平，同一列中含有不同字母表示差异具有统计学意义。

3.6 生活力测定

3.6.1 染色条件的确定 滇重楼种子染色情况受染色的时间、温度和染色液浓度的影响，生活力测定结果见表3。综合染色时间、浓度及染色效果，在30 ℃、0.01%TTC溶液染色效果最好；并且染色7 h与染色8 h无显著差异。因此30 ℃、0.01%TTC溶液中染色7h宜作为滇重楼种子生活力检测的染色条件。

3.6.2 有无生活力鉴定标准的确定 滇重楼种子脱落时，胚极不发育，而是一个很小、未完全分化的多细胞椭圆体，肉眼很难观察到滇重楼种子的胚，根据TTC染色法的原理，结合滇重楼种子的实际情况，有活力的滇重楼种子整个纵切面被TTC染为鲜红色，染色均匀。滇重楼种子有无生活力鉴定标准如下，有活力的滇重楼种子：胚乳被TTC溶液染为鲜红色或浅红色，种子切面全部着色或大部分着色，染色均匀；无生活力的滇重楼种子：胚乳完全不着色或着浅色，染色不均匀；或局部着色，着色较浅。

表3 滇重楼种子生活力测定

注：处理间多重比较采用LSD法，差异显著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差异具有统计学意义。

3.7 发芽率测定

3.7.1 滇重楼种子发芽前处理 由表4可见，经过杀菌剂处理的滇重楼种子在试验结束后种子的发芽率明显高于ck，结果表明，在试验前使用杀菌剂处理种子，能够抑制霉菌污染，保证在试验结束时有足够的种子用于统计发芽率，提高计数的便利性。根据试验结果，滇重楼种子发芽前出理方法为0.1%高锰酸钾溶液浸泡10 min。

3.7.2 适宜发芽床的确定 由表5可见，纸上、沙上、和蛭石3种发芽床处理对滇重楼种子发芽无显著的影响，均可作为滇重楼种子的发芽床，但考虑试验操作的简单性和观察统计的便宜性，选取纸上作为滇重楼种子的最适发芽床。

表4 发芽前不同处理对滇重楼种子发芽率的影响

注：处理间多重比较采用LSD法，差异显著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差异具有统计学意义。

表5 不同发芽床对种子发芽率的影响

注：处理间多重比较采用LSD法，差异显著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差异具有统计学意义。

3.7.3 适宜发芽温度的确定 在纸上黑暗培养条件下，20 ℃条件下种子发芽与15 ℃和25 ℃条件下种子发芽存在显著差异。因此滇重楼种子适宜的发芽温度为20 ℃。

表6 温度对滇重楼种子发芽的影响

注：处理间多重比较采用LSD法，差异显著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差异具有统计学意义。

3.7.4 光照条件的确定 实验结果如表7，种子在光照条件下和黑暗条件下发芽率存在显著差异，所以滇重楼种子发芽时选择全黑条件对其进行培养。

表7 光照对滇重楼种子发芽的影响

注：处理间多重比较采用LSD法，差异显著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差异具有统计学意义。

3.7.5 发芽计数时间的确定 种子置发芽床后第30 d胚根突破种皮约2 mm，以后种子逐渐发芽，第80 d后发芽速率明显下降，100 d后，发芽基本结束，见图1。

图1 滇重楼种子发芽率与发芽时间的关系

因此，整个发芽计数时间在第30～100 d。因此滇重楼种子初次计数时间为30 d，末次计数时间为100 d。

4 结论与讨论

市场滇重楼种子交易物为果实，需去除果皮及假种皮后方可播种，本研究中滇重楼种子是收集果实去除果皮后所得，净度为100%，因此，质量检验规程中未考虑净度分析。

目前，滇重楼种植面积在不断扩大，各种植区间相互引种以及同属植物种子掺入，是引起滇重楼种子混杂的原因，仅仅通过外观形态观测很难对种子真实性进行有效的鉴定，如果做田间鉴定则要到成苗期才能判断，所需时间较长，笔者有意借助分子生物学手段对滇重楼种子进行鉴定，但具体方法有待进一步研究。

在进行滇重楼种子生活力检测时，笔者分别运用TTC法和红墨水法，实验结果发现有活力的种子和通过沸水杀死的死种子均能被红墨水染色，采用红墨水法不能有效测定滇重楼种子生活力。因此TTC染色法是测定滇重楼种子生活力的有效方法。滇重楼种子成熟脱离植株时，胚极不发育，肉眼不可见，在制定滇重楼种子生活力测定的染色标准时，需要参照种子发芽率的测定结果。试验结果显示，以此方法测定的种子生活力越高，其对应种子的发芽率也越高，之后笔者对30个批次的滇重楼种子进行了生活力和发芽率的测定，其结果符合上述规律，证明TTC法测定滇重楼种子生活力方法可靠，鉴定标准成立，结果可信。

先前有学者报道，滇重楼种子具有形态-生理休眠特性，萌发速率慢，萌发率低等原因限制了滇重楼的人工栽培[9]，在本试验中，笔者采用的实验材料为刚从植株上取下去除假种皮后的新鲜种子，之后立即对种子进行处理，处理条件为20 ℃恒温暗培养，结果发现处理30 d后种子开始发芽，100 d后发芽率可达97%以上。这表明，种子采收后立即给予合适的处理条件可以加快滇重楼种子胚形态的发育进程，缩短发芽时间，提高种子发芽率。滇重楼种子发芽进程缓慢，即使在适宜的条件下发芽周期亦长达100 d，在整个发芽进程中，要及时观察发芽床的湿度，应保持发芽床始终保持湿润。同时，培养箱内不能摆放过多的样品，以免影响通风，使向内各处温度不均衡从而影响种子发芽进程。

滇重楼生长缓慢，从种子到药材一般需要5～8年的时间，对于后期滇重楼药材质量标准的研究及划分，以及不同等级的滇重楼种子对应的药材质量等研究，需要后期更长时间的努力。

本研究从扦样、净度分析、真实性鉴定、含水量、千粒重等方面对滇重楼种子检验方法进行了研究，制定了适宜滇重楼种子的检验规程，见表8。

表8 滇重楼种子检验规程

笔者利用本研究建立的滇重楼种子检验规程，先后对30份滇重楼种子样品进行检测，尽管表明不同产地的种子，在发芽率、生活力等指标的测定结果有差异，但是方法稳定，广泛适用于滇重楼种子质量的控制。所以此规程适用于滇重楼种子质量检验，能够为中药材滇重楼种子的规范化生产提供依据。