慢性压迫性颈脊髓病山羊模型的建立与评估

沈宝良，李云飞，韩擎天，高生，沈洪兴，2，殷勇*

(1上海健康医学院附属嘉定区中心医院，上海 201800；2上海交通大学附属仁济医院，上海 200127)

慢性压迫性颈脊髓病(chronic spinal cord disease，CSCD)是由于年龄增长，颈部骨质增生、骨赘形成、椎间盘退化突出、后纵韧带骨化、黄韧带增生肥厚等多种原因造成的颈部脊髓长期受压所产生的一系列临床症状和体征[1-3]。建立科学有效的动物实验模型，可以弥补该病在临床工作中病理机制研究的不足。近年来对慢性压迫性颈脊髓动物模型的研究对象主要集中在啮齿类动物，大型动物的研究较少[4-6]。本实验以山羊为模型动物，采用一种新型的脊髓压迫系统建立了慢性压迫性颈脊髓动物模型，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组 10～12月龄的雌性崇明山羊12只(上海宝山区罗泾锡华实验动物养殖场)，体重30～40 kg，随机分为实验组(9只)和对照组(3只)。实验组9只山羊在模型建立后的第4周、8周和12周时各处死2只，进行病理检测分析。

1.2 球囊压迫装置制作 取1根医用儿童导尿管(8号)，将其前端固定在1枚医用的聚乙烯螺钉内，导尿管与螺钉间的缝隙用硅胶充填，实验前检测无渗漏方可使用。螺钉规格：外侧径10 mm，内侧径8 mm，以上各部分组成实验用的慢性球囊压迫装置(见图1)。

a 未充盈前 b 充盈后

图1 慢性球囊压迫装置

图2 术中显露C3水平硬膜囊

1.3 动物模型制作 造模手术前12 h，实验动物禁食、水，手术区域备皮，用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行静脉麻醉，气管插管后将实验动物仰卧固定于手术台上，颈后垫高固定，保持颈部中立。术前X线片透视定位，确定C3椎体，行颈前旁正中切口，逐层切开皮肤和皮下组织，分离保护颈动脉和气管，暴露C3椎体及上下椎间隙。将定位针置于C3椎体再次透视确定无误后，于C3椎体前正中用空心环钻钻出一直径约8 mm的骨隧道，再用直径10 mm的丝攻扩大骨隧道，暴露硬膜囊(见图2)。测深器确定骨隧道深度，将相同尺寸的聚乙烯螺钉球囊装置慢慢拧入，确定螺钉无松动后逐层缝合切口，导尿管体部用丝线固定于皮肤上。术后每7天经外置导尿管向球囊注射碘海醇造影剂0.1 mL，直至12周。对照组同实验组一样安装好球囊压迫装置，但术后不注射造影剂，每7天记录一次实验数据。

1.4 脊髓运动功能评分 术后采用Tarlov评分[7]进行实验动物脊髓运动功能评分，5分：正常，可跳可跑；4分：能跑但不能跳；3分：能走但不能跑；2分：可站立，但不能走；1分：不能站立但肢体可以活动；0分：肢体完全瘫痪。

1.5 影像学评估 术后第4、8、12周行颈椎X线、CT检查。术后X线片示球囊内造影剂渗漏至椎管内的实验动物予以废弃，同时补充相同量新的实验动物。

1.6 病理学检测 对照组在实验结束后处死，实验组在建模后第4、8、12周时各处死2只，取下实验动物C3椎体节段上下约3 cm的脊髓组织，常规石蜡切片，行HE染色，并在光镜下观察病理学变化。

2 结 果

2.1 脊髓运动功能评分结果 本实验中无实验动物出现意外死亡情况。对照组在各观察时间点脊髓运动功能均正常。实验组在建模术后第4周，所有动物脊髓运动功能均正常(Tarlov评分均为5分)；术后5、7、8周时，分别有1只不能跳跃，但能跑动(Tarlov评分均为4分)；术后第10周时，有2只动物出现不能跑，但可以走动(Tarlov评分分别为3分)，术后第11周时，又有1只动物出现不能跑动，但可以走(Tarlov评分分别为3分)，术后第12周时，有2只动物出现不能走动，但可以站立(Tarlov评分分别为2分)，实验结束，没有动物出现肢体完全瘫痪。

2.2 影像学检查结果 术后第4、8、12周分别行X线、CT检查。影像学结果显示：对照组脊髓未见明显压迫；实验组慢性球囊压迫装置稳定，未见松动，球囊膨胀直径从第1周1.0 mm逐渐增大至第12周5.8～6.4 mm(平均直径6.1 mm)，随着造影剂不断注入，实验动物脊髓呈现逐渐受压态势。术后12周最后一次注射时，X线透视可见实验动物颈椎椎体序列良好，慢性球囊压迫系统装置固定确切(见图3)；CT示球囊向椎管内腹侧压迫(见图4)。

2.3 病理学结果 H-E染色可见：对照组神经元细胞、轴突和白质正常(见图5a、5b)；实验组术后4周时病理学结果与对照组相同，未见明显改变；但术后第8周时，显微镜下见受压节段脊髓前角内神经元细胞变性，胞体出现萎缩变小，但数量未见明显减少，部分白质出现轻度脱髓鞘改变，部分轴突出现空泡样变性(见图5c、5d)；术后12周时，受压节段脊髓神经元细胞变性明显，部分神经元细胞出现坏死，细胞核固缩，白质出现弥漫性脱髓鞘改变，轴突空泡样变性更加明显(见图5e、5f)。

图3 球囊注射造影剂后X线表现 图4 末次注射后CT横断面图像

a 对照组正常神经元细胞 b 对照组正常白质和轴突

c 实验组术后8周神经元细胞变性、萎缩 d 实验组术后8周轻度脱髓鞘和空泡变性

e 实验组术后12周神经元细胞坏死 f 实验组术后12周弥漫脱髓鞘和轴突空泡变性

图5 脊髓慢性压迫神经病理学改变(HE，×100)

3 讨 论

随着人类对于慢性压迫性颈脊髓病的认识不断完善，其对于患者及社会往往会造成很严重的后果，因此对于脊髓压迫的机制研究也从未停止，而建立理想可靠的动物模型对该疾病的研究尤为重要。1999年，Pinazo等用肝肿瘤细胞植入的方法模拟脊髓压迫过程，通过观察肿瘤细胞对局部组织的诱导生长，从而造成对脊髓的慢性压迫[8]。Klironomos等[9]用新西兰兔进行脊髓压迫实验，在兔的C7椎板下方植入芳香聚合物，利用芳香聚合物吸水后可以膨胀的特性，在建模后20周，芳香聚合物诱导形成骨赘以及其本身的膨胀结果，造成对脊髓持续的慢性压迫，成功建立了慢性脊髓压迫动物模型。Hukuda等[10]用犬进行脊髓压迫实验，首次采用颈前路入路将螺钉拧入实验动物C4椎体，然后每天将螺钉拧入1个螺距(约1 mm)，直至实验动物出现脊髓神经功能变化，该方法在当时被广泛应用。而Kanchiku等[11]通过进一步的实验发现，螺钉拧入压迫脊髓产生的是一种非线性压力变化，由于脊髓在椎管内有一定的空间，在螺钉拧入的早期，对脊髓压迫有限，实验动物不会出现脊髓受压后的神经功能变化，而随着螺钉的进一步拧入，即使螺钉拧入的深度很小，脊髓也会出现明显的受压改变，最终导致受压脊髓神经细胞的损害。螺钉拧入的方法虽然能模拟脊髓受压的过程，但是设计本身也存在很多的缺陷，比如金属螺钉本身对于脊髓周围组织的刺激、手术后伤口的感染、实验造成的脊髓压迫是否是慢性压迫仍有争议。而随着医学的发展，科学家也进一步发现颈部脊髓压迫过程绝不是简单的机械压迫，除了常见的骨质增生、骨赘的形成造成的骨性压迫外，椎间盘退化突出、后纵韧带骨化、黄韧带增生肥厚，甚至是肿瘤的生长都可能对脊髓形成慢性持续性压迫。2012年Lee等[12]采用大鼠作为动物模型，用自制的金属颈椎后路慢性脊髓压迫装置植入实验动物体内，成功建模，该模型很好的模拟了脊髓压迫的过程，更重要的是，该动物模型的压迫过程可以量化，能够更好的记录实验动物的神经功能学表现、病理生理学表现与量化的压迫之间的关系，在临床转化的相关研究中具有重要意义。

本实验选择山羊为动物模型，而非以往采用的犬、兔、鼠等小型动物，主要是因为山羊的颈椎更长，更接近人类的颈椎，其次山羊为大型动物，其对于麻醉及手术的耐受较小型动物更加强，术后并发症也更少，而本实验中也确实未发生实验动物因为麻醉及手术而发生意外死亡的情况，再一次证明采用大型动物建模的成功率更加高。

本实验中慢性脊髓压迫装置以医用聚乙烯螺钉和导尿管构成，并不是金属螺钉，主要是基于以下几点考虑：a)聚乙烯材料和导尿管材料相较于金属材料而言，对于实验动物的组织刺激更小，组织相容性更加优越；b)导尿管头端的球囊压迫装置，质地软，与金属螺钉直接拧入相比，可以避免与硬膜囊表面的直接接触而造成损伤；c)采用非金属材质制作压迫装置，在术后进行CT检查时可以避免金属材质产生的伪影而对实验影像结果产生影响，本实验也由于条件有限，未能对实验动物进一步进行磁共振检查，但非金属材料装置的设计，除了价格低廉，也更利于重复建模，术后影像学检查评估途径也更加广泛；d)本实验中建模后将导尿管固定于体表外，每次只要经由尾端注射器向球囊内注射造影剂，避免了每次拧入金属螺钉重复打开伤口对实验动物的伤害，也减少了伤口感染的概率。

本实验研究结果显示，实验组在建模4周时，球囊随着持续注入造影剂而不断增大，但所有实验动物均未出现脊髓神经功能障碍，而到了第8周时实验组有三只山羊出现了神经症状，不能跳跃，但能跑动(Tarlov 评分均为4分)，到了第12周时，又有5只山羊出现了不同程度的脊髓神经功能障碍，而且Tarlov评分更加低，表明脊髓神经损伤更加严重，结合相同时间点的影像学检查及病理检查结果，我们可以看到随着受压节段脊髓受压程度的加深，受压节段脊髓神经元细胞变性逐渐加重，甚至出现坏死，白质脱髓鞘改变及轴突空泡样变性也逐渐加重。我们推测在实验早期，球囊虽然造成一定压迫，但是椎管内本身存在一定空间，脊髓腹侧受压后可以适度向背侧移动，只有随着压迫进一步加重，避让空间消失后才出现一定的神经运动功能障碍。这与临床上的现象相一致：即慢性脊髓型颈椎病早期症状轻，可以持续数年甚至数十年无加重，而随着压迫程度的不断累积，当到达某一个临界点时，病情可以在短时间内突然加重，甚至出现严重的脊髓运动功能障碍。因此我们建议在颈椎病早期症状较轻时就应该引起重视，提早干预，以免压迫进一步加重，造成严重的脊髓损伤。

本实验中实验动物建模手术方法简单，手术时间一般可以控制在30 min左右，手术创伤小；而且球管固定于体外，可以避免反复多次切开，降低了伤口感染的风险；脊髓受压为腹侧压迫，能很好地模拟临床中脊髓腹侧慢性受压的机制。上述这些优点为该建模方法的实用性、可重复性提供了基础。但本实验研究也存在一些不足之处，比如山羊为大型动物，价格较高，饲养成本更大，所以本实验样本量较小；其次是不同时间点用球管尾端针筒向球囊内注射定量的造影剂，实验中我们发现针筒内推管有部分退出，每次注射的量无法精确控制；第三，本实验观察周期为12周，实验结束无一例实验动物出现肢体完全瘫痪，这可能与实验设计时间太短而对实验动物脊髓压迫程度不够有关。因此本实验尚需加大样本量，精确控制每一次注射量，延长观察时间，优化实验步骤，对慢性压迫性脊髓损伤的后续进展和转归做更加深入的统计和分析，更好地实现该动物模型的科研应用价值。