苦参总碱对2，4，6—三硝基苯磺酸大鼠结肠炎的治疗作用及相关机制探讨

肖迅 张燕 李良平

摘要 目的：研究苦參总碱对2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）大鼠结肠炎的治疗作用，对核因子-K B（NF-K B）及其下游细胞因子表达的影响。方法：采用TNBS制备大鼠结肠炎模型，大鼠随机分为TNBS处理组，苦参总碱低、中、高剂量治疗组（100、200、400mg/kg），柳氮磺胺吡啶治疗组及正常对照组（n=10）。将大鼠处死后留取结肠组织标本，观察结肠大体形态变化，并进行病理组织学检查。使用酶联免疫吸附测定法测定TNBS模型大鼠血清中的肿瘤坏死因子-a的含量、白介素一8（IL一8）和白介素-1（IL-1）的含量。结果：给药14 d后，苦参总碱（200、400mg/kg）组及柳氮磺胺吡啶治疗组大鼠体重均高于TNBS组（P<0.05）；结肠黏膜大体形态评分及病理评分低于TNBS组（P<0.05）。血清细胞因子的测定结果显示苦参总碱（200、400mg/kg）能抑制细胞因子TNF-α、IL-1、11-8的表达，并呈现一定的剂量依赖性，与TNBS组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：苦参总碱（200、400mg/kg）能减轻大鼠TNBS结肠炎炎症。

关键词 溃疡性结肠炎；苦参总碱；核转录因子-KB

溃疡性结肠炎是一种肠道非特异性慢性炎症性疾病[1，2]，发病机制目前尚不清。研究表明在溃疡性结肠炎的发生发展中NF-KB起关键作用，在肠道炎症、肠上皮细胞凋亡，甚至肿瘤中常常发现NF-K B有着高表达[3-5]。

苦参总碱作为一种总生物碱，它来源于苦参Sophora flavescens Ait这种豆科植物的根中，按干燥品计算，以氧化苦参碱计，参考国家药品标准中苦参总碱含量的测定方法，采用酸碱回滴法测得苦参总碱含量89.23%。苦参总碱味苦性寒，有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用，民间常用于肠炎和菌痢[6]。苦参总碱具有多种药理作用已被文献报道，包括抗炎、抗氧化、免疫调节、抗病毒[7]，但针对NF-K B信号转导通路影响作用却较少有研究结果。本实验拟观察苦参总碱对大鼠TNBS结肠炎的治疗作用，并测定大鼠TNF-α、IL-8、IL-1和NF-K B的表达水平。通过本研究，我们拟初步探讨苦参总碱对溃疡性结肠炎的治疗作用及相关在TNF-α、NF-K B等因子中的信号通路中的治疗机制，为苦参总碱的临床应用提供有力的实验依据。

资料与方法

建立溃疡性结肠炎大鼠模型：将大鼠50只不禁水禁食24 h，10%水合氯醛（300mg/kg）于腹腔进行注射以达到麻醉的作用，用硅胶管将大鼠插至距离肛门约8cm深左右，缓慢向肠内推人造模液0.25mL（50%乙醇+100mg/kg TNBS）。缓慢注入造模液后采用提尾的方式将大鼠倒置，时间30s，以保证在肠腔内的造模液能弥散均匀地分布。造模后将大鼠人为仰卧归笼，随机平分5组，即柳氮磺胺吡啶组，苦参总碱低、中、高剂量组，TNBS组。另设正常对照组大鼠10只。分别于造模第2天开始给药，采用灌胃的方式。100、200、400 mg/kg分别是苦参总碱低、中、高剂量组的灌胃剂量，给予柳氮磺胺吡啶片（Sulfasalazine，柳氮磺胺吡啶）水溶液670mg/kg灌胃作阳性对照，予等体积生理盐水为对照组和TNBS组的大鼠灌胃，连续治疗14d。3种情况进行综合评分，将3项结果相加的总分除以3即得到DAI值。DAI=（体重指数+大便形状+出血情况）/3。大鼠在末次给药后禁食24h，将大鼠处死，采取的是颈椎脱臼的办法，将结肠剖腹取出，沿肠系膜在肛门处向上将肠腔沿纵轴剪开，取结肠5-8cm，冲洗，利用冷生理盐水进行冲洗，记录水肿、充血发红、溃疡以及糜烂等情况，这是通过肉眼对大鼠结肠大体形态进行观察而得出的，评估结肠黏膜损伤评分。常规进行包埋、切片，做HE染色，对溃疡大小、炎症浸润和组织损伤程度等情况在高倍显微镜下进行观察。

对大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8的表达采用ELISA法进行检测：给药14d后，将眼球摘除取血，待血样放置4h后用离心机进行离心，置20℃将模型大鼠血清备用。临用前将标本取出，待标本达室温。操作应遵循酶联免疫吸附法（Elisa）之试剂盒说明书的步骤方法，加入PBS液后匀浆器匀浆，以3000 r/min离心3min，留取上清液，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定血清中上清液细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1含量，测定血清细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的水平。

结 果

大鼠一般情况及病理组织学检查情况：①一般情况：造模后第2天，TNBS组大鼠出现体重降低、喜贴边扎堆、体毛光泽度降低、厌食、懒动和半稀便，造模后3—4d上述情况最明显。在用苦参总碱和柳氮磺胺吡啶治疗l周后上述情况有所改善，大鼠的大便渐恢复正常，活动增多，无论体重还是进食量均增加，毛色渐有光泽。而直至处死前，TNBS组部分大鼠仍存在稀便或半稀便，体重下降。给药14d后，苦参总碱200mg、400mg组及柳氮磺胺吡啶组DAI值高于TNBS组（P<0.05），而苦参总碱200mg、400mg组与柳氮磺胺吡啶组对比差异无统计意义（P>0.05）。②体重改变：给药14d后，苦参总碱200mg、400mg组及柳氮磺胺吡啶组体重高于TNBS组（P<0.05），而且苦参总碱200mg及400mg组与柳氮磺胺吡啶组对比差异无统计学意义（P>0.05）。③肉眼结肠黏膜大体形态评分：TNBS组大鼠结肠黏膜广泛充血水肿，呈点片状糜烂，肉眼可见肠壁增厚，结肠黏膜出现大小不一的溃疡，肠道粘连，皱襞僵硬消失，肠腔积气，质地脆而易破裂。经苦参总碱治疗后，200 mg及400 mg的苦参总碱组结肠病变较TNBS组减轻，充血水肿减轻，溃疡数目及范围比TNBS组明显减少，无明显粘连现象存在于肠道，肠腔内亦无明显积气，与柳氮磺胺吡啶组相比差异无统计学意义。经秩和检验，大体形态评分，苦参总碱治疗200mg、400mg组及柳氮磺胺吡啶组这两组与TNBS组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而与柳氮磺胺吡啶组对比，差异则无统计学意义（P>0.05）。④病理组织切片：在正常对照组中大鼠结肠黏膜肌层呈现完整的结构，未见炎症和溃疡。TNBS组大鼠结肠黏膜可见炎细胞浸润，结肠腺体消失，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞浸润，黏膜溃疡形成。苦参总碱治疗200mg、400mg组、柳氮磺胺吡啶治疗组大鼠结肠黏膜炎症与TNBS组相比病变明显减轻，病理评分改善（P<0.05）。而苦参总碱200mg及400mg组与柳氮磺胺吡啶组对比，差异无统计学意义（P>0.05）。

炎性细胞因子的测定：与正常组相比，血清TNF-α、IL-1、IL-8的表达水平在TNBS组大鼠中明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。炎性因子TNF-α、IL-1、IL-8的表达在苦参总碱（200、400mg/kg）干预后出现明显降低，呈现一定的剂量依赖性，与TNBS组比较，差异有统计学意义。与柳氮磺胺吡啶组比较，差异无统计学意义。

讨 论

溃疡性结肠炎发病机制目前尚未阐明，目前认为与环境、遗传及免疫等有关。本实验结果表表明，血清中TNF-α、IL-1、IL-8含量模型组均显著高于正常对照组，苦参总碱（200、400mg/kg）及柳氮磺胺吡啶均可使大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-8的水平显著降低，且苦参总碱（200mg及400mg）组降低上述细胞因子水平与柳氮磺胺吡啶组相比，无差异。说明苦参总碱可通过降低结肠炎模型大鼠的炎性细胞因子分泌，从而使肠道炎性反应和黏膜损伤减轻，进而起到对溃疡性结肠炎的治疗作用。

作为一种转录因子，NF-KB有多向转录调节作用，能对众多炎性反应的相关基因进行转录调控，此外，在细胞因子网络平衡失调的复杂状态中，其中的一个中心环节便是NF-K B活化，对其他炎性反应的促进和炎性因子的释放起到关键作用。在静息状态时，在胞质中，NF-K B与其抑制物是以无活性复合物的形式存在的，当受到胞外免疫信号刺激时，可以使IKB激酶激活，从而引起IKB抑制因子的磷酸化和解离，令NF-K B的核转位结构域暴露，从而造成NF-K B进入核内，使各种致炎因子（如TNF-α和IL-12）的转录激活，介导肠道黏膜的天然免疫反应，通过信号转导途径一系列激酶被激活，迅速移位到胞核，调控相对应的靶基因及细胞的增殖、活化、凋亡，调节基因转录。体内对NF-K B活化进行调控的主要路径如下：①TNF-α和IL-1 β的基因转录通过NF-K B活化而增强，增加IL-1 B和TNF-α的产生、释放，再次使NF-K B激活；②NF-K B活化，产生和释放的IL-8增多，导致最初的炎症信号得到进一步的放大。研究表明NF-K B活化可能是UC发生发展的关键点基于NF-K B对炎性细胞因子的调控作用，通过研究，可认为对NF-KB活化进行抑制，从而使复杂促炎因子TNF-α、IL-1、IL-8的水平下调，可能是苦参总碱治疗溃疡性结肠炎发病的重要作用机制之一。这一结果与既往文献一致。研究发现IK B-a蛋白水平可通过氧化苦参碱获得下调，使NF-K B活性受到抑制，使促炎因子IL-2、IL-6、TNF-a、11-1 B、IL-8等释放减少，从而达到治疗目的。范恒等研究表明氧化苦参碱（100mg/kg）可通过促进淋巴细胞β-抑制蛋白2（β2AR）和淋巴细胞β-抑制蛋白2（B-arrestin2）的表達，使β-arrestin2对NF-K B活化的抑制作用增强来达到缓解TNBS诱导的大鼠结肠炎的作用。柳青等研究表明氧化苦参碱可抑制NF-K B mRNA和TLR9的表达以抑制溃疡性结肠炎的炎性反应。

综上所述，苦参总碱能改善TNBS大鼠结肠炎症状，降低结肠大体形态评分，减轻肠道炎性反应和黏膜损伤。苦参总碱能抑制炎性因子TNF-α、IL-1、IL-8的分泌。苦参总碱能下调NF-K B的表达。

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