脱脂椰麸谷蛋白-1抗氧化性的研究

郭帅，李艳

（1.晋中学院，山西榆次030619；2.山西师范大学食品学院，山西临汾041004；3.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌571339）

现代医学证明人体的许多疾病与体内自由基的失衡密切相关[1-2]。机体内过量的羟基自由基、超氧根离子自由基可进一步引发多种化学反应，生成一系列化学物质，从而使人体自由基失衡，最终导致各种疾病的发生[3]。同时，自由基引发的氧化-还原反应失衡也是导致食品品质下降、腐败变质的重要因素。因而，控制机体内过量自由基的产生十分关键。抗氧化剂是能够有效清除自由基的物质，在食品工业中的应用非常广泛。目前常用的抗氧化剂多为化学合成类抗氧化剂，但因安全性问题其使用量和使用范围受到越来越严格的限制。因此，寻找安全、高效、无毒的天然抗氧化剂成为研究的热点。谷蛋白-1（glutelin-1）是蛋白质家族中较为特殊的一员，它是溶解于稀酸溶液中的一类蛋白质的总称[4]。大多数植物蛋白质的等电点为pH3.0～5.0，在等电点附近，大多数植物蛋白溶液的静电荷为零，溶解度最低；而谷蛋白-1的等电点较高，在此pH范围内的溶解度较好，因而在食品工业尤其是酸性食品中有潜在的用途。前期的研究表明，椰子蛋白中含14.4%的谷蛋白-1，脱脂椰麸谷蛋白-1能够有效降低小鼠的血清胆固醇，具有抗氧化的潜力[5-6]。椰麸（coconut cake）是椰肉榨汁后的副产物，含有8%～16%的蛋白质，是丰富的植物蛋白质资源[7]。然而，目前椰麸仅仅被用作动物饲料或蛋糕等食品的辅料，蛋白质等活性成分没有被开发利用，造成了资源的极大浪费。本试验以脱脂椰麸为原料制备谷蛋白-1，研究脱脂椰麸谷蛋白-1的抗氧化性，以期为椰麸的开发利用提供理论基础和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椰麸：南椰食品科技有限公司；三氯乙酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、冰乙酸、三氯化铁：天津科密欧公司；2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、Ferrozine试剂、没食子酸：Sigma公司。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪（IFFM-E）：香港BUCHI公司；电热恒温鼓风干燥箱（PYX-DHG-9101-25A）：广东韶关科力实验仪器有限公司；磁力搅拌器（JB-3）：上海智光仪器仪表有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1200）：北京普析通用仪器有限责任公司；型台式高速冷冻离心机（D-78532）：德国Httch公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂椰麸的制备

椰麸→50℃、鼓风干燥箱中干燥4 h→粉碎→过60目筛→加入石油醚（料液比=1∶10，g/mL）→振荡脱脂2 h→过滤→弃滤液→重复脱脂3～4次→脱脂椰麸

1.3.2 脱脂椰麸谷蛋白-1的制备

参照Kwon等[8]的方法，50 g脱脂椰麸中加入300 mL、0.4 mol/L NaCl，4℃下搅拌提取 8 h，弃去过滤，收集滤渣。在滤渣中再次加入300 mL、0.4 mol/L NaCl，如此重复提取3次，弃去滤液，以除去椰子清蛋白和球蛋白。收集滤渣，加入50%冰乙酸，4℃下搅拌提取8 h，重复提取3次，合并提取液。然后在4℃、10 000 g下离心30 min，收集上清液，装入截留分子量为4 000 Da的透析膜中，4℃下、在dH2O中透析24 h，每隔2小时换一次dH2O，将透析液冷冻干燥后即得到脱脂椰麸谷蛋白-1（defatted coconut cake glutelin-1，DCCG-1）。脱脂椰麸中蛋白质含量用微量凯氏定氮仪法测定（N×6.25），而提取液中蛋白质含量按照Bradford法[9]进行。

1.3.3 氨基酸组成分析

参照Wang等[10]的方法，在0.1 g DCCG-1中加入5 mL、6 mol/L的盐酸中，110℃下水解24 h。用0.45 μm的膜过滤水解液，收集滤液，在HITACHI L-8900型氨基酸自动分析仪上测定。

1.3.4 DCCG-1对超氧根离子自由基的清除作用

将按照1.2.2制备的DCCG-1复溶于0.1 mol/L乙酸钠缓冲溶液（pH2.0）中，分别配制成50 μg/mL～250 μg/mL的溶液，用于抗氧化试验。

参照文献[11]的方法：取DCCG-1溶液0.1 mL，加入到3 mL、3 mmol/L的邻苯三酚溶液中，混合均匀后，在320 nm下比色，每隔30秒记录一次吸光值，共记录10 min。模型管用dH2O代替样品，以BHT做对照。

超氧根离子的清除率/%=（1-A样品/A模型）×100

式中：A样品为样品管的吸光值，A模型为模型管的吸光值。

1.3.5 对ABTS+·的清除作用

参照文献[12]的方法：将20 μL DCCG-1溶液与2 mL ABTS溶液（7 mmol/L）混合均匀，30℃下暗反应6 min，然后在734 nm下比色。模型管用dH2O代替样品，以BHT做对照。

式中：A样品为样品（或对照）管的吸光值，A空白为空白管的吸光值。

1.3.6 对羟基自由基的清除作用

参照文献[13]的方法：在1.34 mL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH7.4）中依次加入28 mmo1/L的脱氧核糖溶液0.3 mL，28 mmol/L的双氧水0.3 mL，2.5 mmol/L的三氯化铁溶液30 μL，l mmol/L的EDTA-Na20.3 mL以及0.1 mL、100 μg/mL的DCCG-1溶液。然后添加30 μL、10 mmol/L 抗坏血酸引发反应，37℃水浴 1 h，加入0.3 mL硫代巴比妥酸溶液（1%），30 μL三氯乙酸（28%），100℃，水浴20 min，冷却后532 nm下测吸光值。模型管用dH2O代替样品。以BHT作对照。

羟基自由基的清除率/%=（1-A样品/A模型）×100

式中：A样品为样品（或对照）管的吸光值，A模型为模型管的吸光值。

1.3.7 Fe2+络合能力的测定

参照文献[12]的方法：移取50 μL、不同浓度的DCCG-1 溶液（50 μg/mL～250 μg/mL）于试管中，加入1 mmol/L 的 FeSO4溶液 25 μL，5 mmol/L 的 Ferrozine试剂50 μL，室温反应10 min后，用甲醇定容到3 mL，在562 nm下测吸光值。模型管用甲醇代替样品，用BHT作对照。

式中：A样品为样品（或对照）管的吸光值，A模型为模型管的吸光值。

1.3.8 还原能力测定

参照文献[14]的方法：移取200 μL的DCCG-1溶液于试管中，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L，pH6.6），1 mL铁氰化钾溶液（1%），混合后于50℃水浴加热20 min，然后加入10%的三氯乙酸1 mL，4 000 r/min常温离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL dH2O以及400 μL三氯化铁（1 g/L），混匀后在700 nm测吸光值，用BHT作对照。

1.4 数据处理

试验采用邓肯氏新复极差法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 氨基酸组成

DCCG-1的氨基酸组成与含量如表1所示。

表1 脱脂椰麸谷蛋白-1的氨基酸组成和含量Table 1 Composition and content of amino acid in DCCG-1 g/100 g蛋白质

从表1可以看出，DCCG-1含有16种氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸的含量都较高。8种必需氨基酸中，色氨酸的含量很低，为第一限制性氨基酸。但DCCG-1中亮氨酸、异亮氨酸和苏氨酸的含量以及必需氨基酸总和（total of essential amino acids，TEAA）均显著高于FAO/WHO[15]的推荐值（12.7 g/100 g蛋白质），表明DCCG-1的氨基酸组成相对合理。值得注意的是，DCCG-1中精氨酸、芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）和支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸）的含量较高，但缺乏半胱氨酸。研究表明，蛋白质或多肽链中这几类氨基酸的含量与蛋白质或多肽的抗氧化性密切相关[11-14，16]。例如，芳香族氨基酸中苯环上的酚羟基可以快速给出质子，有效清除自由基[14]；而含硫氨基酸中的二硫键或巯基与蛋白质的金属离子络合能力密切相关[13-14，17]。

2.2 DCCG-1的抗氧化能力

2.2.1 DCCG-1对超氧根离子自由基（O2-·）的清除能力

O2-·是机体受损或代谢失衡时最先产生的自由基之一。O2-·会引发一系列化学反应，产生更多的自由基，引发氧化反应的进一步发生，直至对机体细胞或器官造成损伤。因而O2-·既是机体氧化反应的产物，也是许多氧化反应的引发物和底物[12，18]。O2-·清除能力已经成为衡量抗氧化剂活性的重要指标之一。DCCG-1对超氧根离子自由基（O2-·）的清除能力见图1。

图1 DCCG-1对O2-·的清除能力Fig.1 Scavening activity of DCCG-1 on O2-·

结果表明，与BHT相比DCCG-1具有更高的O2-·清除能力，这可能与DCCG-1中大量的苯丙氨酸和酪氨酸有关（表1所示），苯丙氨酸和酪氨酸所含的酚羟基可以提供质子而作为还原剂，有效猝灭O2-·，从而阻止氧化反应的进一步发生[14]。同时，随着浓度的提高，DCCG-1的清除能力也提高。

2.2.2 DCCG-1对ABTS+·的清除能力

ABTS+·被广泛应用于测定抗氧化剂的总抗氧化能力了。图2显示了DCCG-1在不同浓度下对ABTS+·的清除能力。

图2 DCCG-1对ABTS+·的清除能力Fig.2 Scavening activity of DCCG-1 on ABTS+·

结果表明，随着DCCG-1浓度的升高，其ABTS+·清除能力也逐渐变大。且在被测的浓度范围内，DCCG-1对ABTS+·的清除能力显著大于BHT。这可能与其氨基酸组成有关。如表1所示，DCCG-1中精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及支链氨基酸的含量都较高，尤其是精氨酸。这些氨基酸所含的一些基团，如胍基、酚羟基、支链氨基等，均可以提供质子，有效清除过量的游离自由基，阻止氧化反应的发生。BHT是工业中最常用的抗氧化剂和自由基清除剂。本试验的结果表明，DCCG-1具有较高的总抗氧化能力。可以利用这一性质，将DCCG-1添加到肉汤、火腿等食品中，提高产品的货架期。

2.2.3 DCCG-1对羟基自由基的清除能力

·OH是已知的活性氧中对生物体毒性最强的一种自由基，它可以通过多种反应破坏生物体的各种大分子，如蛋白质、脂肪和DNA，特别是维生素B1和鸟嘌呤核苷[18]，对生物体造成很大程度的损伤。DCCG-1对·OH的清除能力见图3。

图3 DCCG-1对·OH的清除能力Fig.3 Scavening activity of DCCG-1 on·OH

如图3所示，随着浓度的增大，DCCG-1对·OH的清除能力逐渐升高。DCCG-1的·OH清除能力要显著低于BHT。然而，200 μg/mL的DCCG-1对·OH的清除能力（20.48%）要显著高于油棕粕谷蛋白-1（12.14%）[13]和米糠蛋白的清除能力（7.42%）[16]，这表明DCCG-1具有一定的·OH清除能力。

2.4 DCCG-1对Fe2+的络合能力

在生物体内，Fe2+不仅可催化脂质过氧化反应，还能与活性氧反应产生羟基自由基，从而破坏生物体的生物大分子，生物体的抗氧化剂能够络合二价铁离子而降低其损害。DCCG-1对Fe2+的络合能力见图4。

图4 DCCG-1对Fe2+的络合能力Fig.4 Chelating ability of DCCG-1 on Fe2+

如图4所示，在 50 μg/mL～250 μg/mL 的浓度范围内，DCCG-1对Fe2+的络合能力显著低于BHT。这可能与其缺乏含硫氨基酸有关。研究表明，蛋白质中的巯基或二硫键可以有效络合Pb2+、Fe2+、Cu2+等金属离子，这类蛋白质既可以作为有效的抗氧化剂，也可以用作重金属解毒剂[19]。

2.5 DCCG-1的还原力

DCCG-1的还原力见图5。

图5 DCCG-1的还原力Fig.5 Reducing power of DCCG-1

在700 nm下的吸光值越高，表明该抗氧化剂的还原力越高，抗氧化性越强。如图5所示，DCCG-1的还原力显著高于BHT，且随浓度的增大DCCG-1的还原力也逐渐增强。

3 结论

本试验结果表明，DCCG-1对超氧根离子自由基和ABTS+自由基具有较强的清除能力；同时表现出较高的还原力和一定的羟基自由基清除能力和Fe2+络合能力，这表明DCCG-1具有较强的抗氧化性；同时，由于脱脂椰麸的产量巨大，来源丰富，价格低廉，DCCG-1的制备工艺也相对简单，因而DCCG-1具有开发为天然抗氧化剂的潜力。然而，大分子蛋白无法进入血液循环中直接发挥抗氧化活性；一些大分子蛋白被摄入后，容易被人体胃肠道消化系统中的酶降解，或生成多个无生物活性的肽段，或生成生物活性更强的肽段。因此，DCCG-1在体内是否具有抗氧化活性，还需要进一步的研究。