益生菌对高海拔缺氧条件下肉鸡生产性能和肠道功能的影响

李 龙，刘锁珠，王宏辉，董 滢

(1.杨凌职业技术学院 动物工程分院，陕西 杨凌 712100；2.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000)

益生菌被定义为“当摄入充足数量时对动物健康发挥有益的活的微生物的总称”[1]。益生菌作为一种绿色、安全的微生态制剂已广泛地用于动物生产中，国内外有关其应用效果的报道也很多。大量研究表明日粮添加益生菌能够改善肉鸡生产性能[2]，提高营养物质消化率[3]，抑制肠道致病菌生长[4]，调节机体免疫功能[5]。但目前关于益生菌对高海拔缺氧环境下肉鸡生产性能的影响还未见报道，因此本试验旨在研究益生菌对高原缺氧条件下肉鸡生产性能、肠道消化酶活性和肠道形态的影响，为后期益生菌在高原肉鸡生产中的研究和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 益生菌菌粉的制备

试验中所用的益生菌(LactobacillusplantarumJM113)菌株是从健康藏鸡肠道中分离获得，该菌株具有较好的耐酸耐胆盐特性、粘附特性和抑菌效果。益生菌菌粉制备过程参照文献[6]提供的方法进行。

1.2 试验动物及试验设计

1.2.1 试验动物 270只1日龄健康AA肉仔鸡随机分为3组，每组6个重复，每个重复15只鸡，试验期42 d。试验期内肉鸡饲喂全价商品日粮，1～21日龄饲喂前期日粮，22～42日龄饲喂后期日粮。3个处理组分别为：(1)对照组饲喂基础日粮；(2)抗生素组在基础日粮中添加金霉素(添加剂量为50 mg/kg)；(3)益生菌组在基础日粮中添加Lactobacillus plantarum JM113菌粉(添加剂量为109CFU/kg)。

1.2.2 饲养管理 本试验在西藏林芝地区西藏农牧学院教学实习基地(海拔 2986 m)进行，所有试验鸡饲养在 3 层金属鸡笼内，每个处理 6个鸡笼，每个鸡笼 15只鸡，前期(1～21 d)饲养密度为 15 只/m3，后期饲养密度为 7.5 只/m3，试验期内鸡自由采食和饮水。第 1 周鸡舍温度为 30～33 ℃，之后逐渐降低，3周后温度保持在 23～25 ℃。 每天23 h 照明， 1 h熄灯。消毒和免疫程序按常规程序进行。

1.3 生产性能测定

在试验期1 d，21 d和42 d分别称量每个重复鸡只的总重量和总采食量，并计算平均日采食量ADFI和饲料转化率FCR。

1.4 样品采集和测定

1.4.1 肠道形态 在21和42日龄每个重复随机选取2只鸡，颈静脉放血处死后解剖，剪取十二指肠端部，放入装有4%福尔马林的棕色瓶中固定，收取剩余十二指肠中的内容物，迅速放于-20 ℃冰箱保存。固定的十二指肠利用冰冻切片机制备厚度成6 μm的冰冻切片，HE染色，电子显微镜下(40倍)测定肠绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)，每个样品选择10个不同典型视野，每个视野绒毛高度和隐窝深度分别测定10个数值。肠道内容物在测定前用生理盐水进行10倍稀释并匀浆，离心，保留上清液。通过试剂盒测定上清液中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性(南京建成生物工程研究所)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4.2 微生物群落分析 无菌采集肉鸡盲肠内容物，利用粪便DNA提取试剂盒(OMEGA)提取肉鸡盲肠内容物菌群总基因组DNA，采用特异性引物对肉鸡盲肠中总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌进行PCR扩增，引物序列见表1。将含有特定菌群16S rRNA基因的质粒从 1×103～1×109(copies / mL)逐级稀释构建标准曲线，荧光定量采用采用25 μL反应体系，其中SYBR Premix (Takara) 12.5 μL，上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，灭菌水9.5 μL，模板2 μL。每个样品做三个重复。乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的含量以菌群/总菌来表示。

1.5 统计分析

所有试验数据采用SPSS 16.0 软件的one-way ANOVA进行单因素方差分析，Dancan法进行多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果用平均值±标准差表示。

表1 特定菌群荧光定量引物[7-8]Table 1 Fluorescent quantitative primer for specific bacteria flora

2 结果与分析

2.1 益生菌对高原缺氧条件下肉鸡生产性能的影响

本研究发现，日粮中添加益生菌或抗生素对肉鸡生长前期(0～21日龄)的BW、ADFI和FCR均无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，益生菌显著提高了生长后期的BW(P<0.05)，且与抗生素组差异不显著(P>0.05)。益生菌组和抗生素组肉鸡生长后期的FCR均显著低于对照组(P<0.05)。生长后期各组之间FCR差异不显著(P>0.05)(见表2)。

表2 益生菌对高原缺氧条件下肉鸡生产性能的影响Table 2 Effect of probiotics on growth performance of broiler reared at hypoxic environment

注：同行数据肩标字母不相同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同。
Note: Values with different superscripts in the same row mean significant difference (P<0.05), the same superscripts insignificant difference (P>0.05).The same below.

2.2 益生菌对肉鸡肠道消化酶活性的影响

益生菌对高原缺氧条件下肉鸡肠道消化酶活性的影响见表3。与对照组相比，日粮中添加益生菌可以显著提高21 d肉鸡肠道淀粉酶活性(P<0.05)，但是对胰蛋白酶和脂肪酶活性无显著影响(P>0.05)。42日龄肉鸡肠道中淀粉酶活和脂肪酶活性均显著高于对照组和抗生素组(P<0.05),但对照组与抗生素组在3种消化酶活性上均无显著差异(P>0.05)。

表3 益生菌对高原缺氧条件下肉鸡肠道消化酶活性的影响Table 3 Effect of probiotics on digestive enzyme activity of broiler reared at hypoxic environment IU/mL

2.3 益生菌对肉鸡十二指肠形态的影响

益生菌对高原缺氧条件下肉鸡十二指肠形态的影响见表4。相比于对照组和抗生素组，益生菌处理组显著提高了21 d和42 d肉鸡绒毛长度和V/C比值(P<0.05)。与对照组相比，抗生素处理组在绒毛高度、隐窝深度和V/C比值上均无显著差异(P>0.05)。

2.4 益生菌对肉鸡盲肠微生物群落的影响

由表5可见，相比于对照组，抗生素处理组显著降低了肉鸡盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌含量(P<0.05)，益生菌处理组显著提高了乳酸杆菌含量(P<0.05)，并显著降低了大肠杆菌和沙门氏菌含量(P<0.05)。益生菌处理组肉鸡盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌含量显著高于抗生素处理组(P<0.05)。

表4 益生菌对高原缺氧条件下肉鸡十二指肠肠道形态的影响Table 4 Effect of probiotics on intestine structure of broiler reared at hypoxic environment μm

表5 益生菌对高原缺氧条件下肉鸡盲肠菌群组成的影响Table 5 Effect of probiotics on microbiota composition of broiler reared at hypoxic environment

3 讨 论

在本研究中，益生菌对肉鸡生长前期(0～21日龄)的生产性能没有显著影响。在生长后期(22～42日龄)，抗生素和益生菌均显著地改善了FCR，提高了肉鸡42日龄体重，且益生菌与金霉素具有相似的效果。Peng 等[9]研究发现，日粮添加益生菌显著提高了生长后期的平均日采食量和饲料转化率。而Shokryazdan等[10]研究发现，日粮添加益生菌显著提高肉鸡42日龄体重和生长后期的饲料转化率。不同的益生菌饲养试验测定的生产性能存在差异，这可能是不同试验使用的菌株、计量、饲喂方式等存在差异造成的。本试验中益生菌提高肉鸡42日龄体重和降低饲料转化率可能与肠道淀粉酶活性和脂肪酶活性的增加、改善肠道形态有关。消化酶对营养物质的消化是动物吸收营养的第一步，其活性高低直接影响动物对日粮的利用效果，进而影响动物的生产性能。肠道中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的高低直接反应了机体对淀粉、脂肪和蛋白质消化能力[11]。生长后期是肉鸡脂肪沉积的主要阶段，同时肉鸡对能量的需要量也大幅增加，因此脂肪酶活性和淀粉酶活性的高低直接关系到脂肪沉积量。本试验研究发现，益生菌可以显著提高42日龄的十二指肠淀粉酶活和脂肪酶，而抗生素对消化酶的酶活没有显著影响。Li 等[12]发现，益生菌可以显著增加肉鸡肠道中的脂肪酶活性。Sun 等[13]和Wang等[14]发现，给肉鸡饲喂含有益生菌的日粮后肠道中的脂肪酶和蛋白酶活性显著提高，但益生菌对淀粉酶活性无影响。不同的益生菌菌株产酶活性存在差异，这可能是各研究结果不尽相同的主要原因。

益生菌促生长的另一个主要原因是改善动物机体的肠道形态，其中小肠是营养物质吸收的主要部位。小肠的吸收能力与肠绒毛高度和隐窝深度有密切关系。肠绒毛越长，表面积越大，越有利于营养物质的吸收，而隐窝深度反应肠细胞的生成速度，研究中常以V/C作为肠绒毛吸收能力的综合指标。本研究发现，在21 d和42 d，添加益生菌均能显著提高肉鸡的肠绒毛高度和V/C。Shokryazdan等[10]研究表明，日粮添加益生菌可以显著提高V/C。 Wang等[14]研究表明，益生菌可以显著提高肉鸡绒毛高度和V/C。而益生菌改善肠道结构的原因目前发现有三种：(1)益生菌的中间代谢产物或特殊酶系能够促进肠上皮细胞生长[15]；(2)抑制病原菌从而保护肠上皮细胞免受病原菌的损伤[16]，在本试验中同样发现益生菌能够增加肠道有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌含量，降低有害菌大肠杆菌和沙门氏菌含量；(3)益生菌会产生挥发性脂肪酸(特别是丁酸)促进肠上皮细胞分裂[17]。虽然本试验发现益生菌能够提高肉鸡肠绒毛高度和V/C比值，但其机理还有待进一步研究。

此外，益生菌还可能通过别的途径提高营养物质的利用率，从而改善生产性能。益生菌提高生产性能可能有以下原因：(1) 某些益生菌可以分泌一些胞外消化酶包括淀粉酶，从而补充肠道消化酶，提高营养物质利用率[18]；(2) 益生菌可能会刺激肠道细胞分泌更多的内源酶，促进营养物质的消化；(3) 益生菌在肉鸡体内能够黏附着在淀粉颗粒上，促进淀粉的消化；(4) 益生菌产生有机酸，一般消化酶的最适pH为偏酸性，而有机酸的产生可加强肠道的蠕动和胃液分泌，进而促进消化吸收，增强消化酶活性[19]。本研究中虽然金霉素也可以提高肉鸡的生产性能，但是对金霉素对消化酶活和肠道形态均没有显著影响。金霉素提高肉鸡生产性能主要是通过减少肠道微生物或改变肠壁厚度实现的。考虑到抗生素滥用会对动物和环境带来一系列负面影响，而益生菌具有安全无污染的特性，因此益生菌可以作为高海拔地区肉鸡饲料添加剂。

4 结 论

本研究结果表明，益生菌可以提高高海拔缺氧条件下肉鸡消化道中消化酶活性，改善肠道形态，从而提高生产性能，因此益生菌可能作为高海拔缺氧条件下肉鸡日粮的一种添加剂。