液质联用技术应用于分析化学实验教学的探索

王 莹， 丁 越， 王新宏， 张 彤

(上海中医药大学 a. 中药学院; b. 教学实验中心， 上海 201203)

0 引 言

分析化学是发展和和应用各种理论、方法、仪器和策略以获得有关物质在空间和时间方面组成和性质信息的一门科学，是最早发展起来的化学分支学科，其在科学体系中的重要作用不言而喻。分析化学是高等学校化学化工、生物学、材料学、医药学、环境科学等专业的主干基础课程之一。分析化学课程体系中既有严密而系统的理论，还有很强的实用性，是理论与实际密切结合的学科。通过本课程的学习，学生不仅需要掌握分析化学的基本理论，更需要掌握不断发展和更新的实验方法。

液相色谱-质谱联用技术集色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度和高专属性于一体，是当今分析化学中最重要的定性和定量分析技术之一[1]。液质联用中色谱技术的优势在于对待分析的混合物进行有效的分离，但色谱方法有时无法实现定性和定量的检测功能，比如常规的紫外检测器对无紫外吸收的化合物的检测以及未知化合物的定性都无能为力。质谱法能提供丰富的分子量信息，并能够同时监测化合物的母离子和子离子进行定量分析，因此具有较高专属性和灵敏度。质谱法与色谱方法联用，在药物分析、食品分析和环境分析等领域得到了广泛应用[2-5]。根据学校实验教学要求，将前期成熟的科研成果应用于实验教学中，形成“液相色谱-质谱联用技术对中药黄芩中黄芩苷和黄芩素的定性和定量分析”实验课程教学内容，在实验教学中取得了良好的效果。

1 实验原理

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，味苦性寒，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效。现代药理研究表明，黄芩在抗炎、抗氧化、抗缺血再灌注损伤、调节免疫、保肝以及抗肿瘤等多方面具有潜在的开发应用价值[6-8]。黄酮类化合物是黄芩的主要药效物质基础。其中，黄芩苷和黄芩素含量较高，活性明确，是评价黄芩质量优劣的主要指标[9]。黄芩苷和黄芩素的分子式分别为C21H18O11、C15H10O5，化学结构式为：

黄芩苷Baicalin; mol.wt. 446

黄芩素Baicalein; mol. wt.270

本实验利用液相色谱-质谱技术，采用葛根素作为内标，对黄芩药材中黄芩苷、黄芩素进行结构鉴定和定量分析。该方法与紫外分光光度法[10]和高效液相色谱法[11-13]相比，具有灵敏、准确、快速等特点。

2 实验材料和仪器

2.1 仪器

Agilent l290液相色谱系统(包括G4220A型二元输液泵，G4226A型自动进样器，Gl316C型柱温箱)，Agilent 6460 Triple Quad LC/MS 三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源(ESI源)，美国Agilent公司；梅特勒XS105DU 分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；SB3200 超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)；0.45 μm滤膜过滤器、微量注射器。

2.2 材料与试剂

黄芩药材，批号：130401，购自上海康桥中药饮片有限公司；黄芩苷对照品，中国药品生物制品检定所，批号：110715-201016，供含量测定用；黄芩素对照品，中国药品生物制品检定所，批号：111595-200904，供含量测定用；葛根素对照品，中国药品生物制品检定所，批号：0752-9605，供含量测定用；甲醇、乙腈(色谱纯，Merk)，上海国药集团化学试剂有限公司；超纯水。

3 方法与结果

3.1 色谱条件及质谱条件

(1) 色谱条件。色谱柱：Eclipse XDB C18(50 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)，C18保护柱(10 mm × 2.1 mm × 3.5 μm)；流动相：溶剂A：水(0.1%甲酸水溶液)，溶剂B：甲醇(0.1%甲酸甲醇溶液)；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL。流动相梯度洗脱比例见表1。

表1 HPLC-MS/MS流动相梯度洗脱条件

(2) 质谱条件。 离子源：电喷雾离子化源(ESI)；离子源喷射电压：+4 kV；干燥气(N2)流速：10 L/min；干燥气温度：350 ℃；雾化气(N2)压力：275.8 kPa(40 psi)；质谱检测器选择性监测条件见表2，黄芩苷、黄芩素和葛根素色谱图见图1～3。

3.2 试样制备

(1) 对照品贮备液。分别称取黄芩苷、黄芩素对

表2 HPLC-MS-MS质谱检测器监测参数

图1 黄芩苷对照品HPLC-MS/MS色谱图

图2 黄芩素对照品HPLC-MS/MS色谱图

图3 葛根素对照品HPLC-MS/MS色谱图

照品约5 mg，精密称量，置25 mL容量瓶中，采用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，黄芩苷、黄芩素对照品贮备液浓度分别为187 μg/mL、25.2 μg/mL。

(2) 内标溶液。称取葛根素对照品约5 mg，精密称定，置50 mL量瓶，甲醇溶解并稀释至刻度，准确吸取上述葛根素溶液适量，50 %甲醇水溶液稀释制成浓度为10 μg/mL内标溶液。

(3) 对照品溶液的配制。准确吸取黄芩苷、黄芩素对照品贮备液适量，加50%甲醇水溶液稀释成系列浓度对照品溶液，其中黄芩苷浓度分别为:46.75，23.38，11.69，5.85，2.925，1.462 5 μg/mL；黄芩素浓度分别为：6.3，3.15，1.575，0.787 5，0.393 8，0.196 9 μg/mL。

(4) 供试品溶液的制备。 黄芩药材50 g粉碎，取约0.1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加50 %甲醇适量，超声处理30 min，放置，冷却至室温，转移至50 mL量瓶中，以50 %甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤。

3.3 进样分析

分别精密移取系列对照品溶液和供试品溶液各0.4 mL，加内标溶液1 mL，50 %甲醇水溶液稀释至10 mL。各进样2 μL，记录总离子流色谱图、黄芩苷、黄芩素及葛根素质谱图和色谱图。供试品溶液重复测定3次。

4 结果与分析

4.1 定性分析

黄芩苷(相对分子质量446.35)在正离子检测方式下的[M+H]+峰为准分子离子峰，m/z为447.1；二级质谱特征离子的m/z为271.0，由准分子离子m/z447.2的[M+H]+失去一分子的葡萄糖醛酸产生，与对照品的质谱图和色谱保留行为对照可确认为黄芩苷。同法确认黄芩素准分子离子m/z271.2及二级质谱离子m/z123.3，葛根素(内标)分别为m/z417.0及m/z296.9。

4.2 定量分析

(1) 分别以黄芩苷、黄芩素与内标峰面积比值和对照品浓度作线性回归，并计算回归方程、相关系数和线性范围(见表3)。

表3 黄芩苷与黄芩素线性关系考察

结果表明：黄芩苷浓度在0.058 5～1.87 μg/mL范围内，进样量与峰面积线性关系良好，线性回归方程为:Y=0.004 493X-0.098 62，γ=0.995 6；黄芩素浓度在0.007 88～0.252 μg/mL范围内，进样量与峰面积线性关系良好，线性回归方程为:Y=0.000 899 6X+0.005 768，γ=0.999 6。

(2) 分别将黄芩苷、黄芩素与内标峰面积比值的峰面积值代入回归方程，计算黄芩药材中黄芩苷和黄芩素的含量(见表4)。

表4 黄芩药材中黄芩苷和黄芩素含量测定结果

结论：黄芩药材中黄芩苷的含量为15.81%，黄芩素的含量为1.99%。

5 结 语

近年来，随着素质教育的提出，各高校越来越注重培养学生的实际动手能力。大型仪器设备是高等学校从事教学、科研的重要条件和基本手段，利用大型仪器设备指导学生科研不仅可以提高大型仪器设备的使用效率，同时对提高学生的科研能力也有益处[14-15]。我校分析化学实验教学改革中，在利用大型仪器设备进行实验教学活动中，取得了一定的经验。在中药学、药学等专业本科生的实验教学中，引入高效液相色谱、气相色谱、红外光谱、原子吸收光谱和高效液相色谱-质谱联用仪等大型实验仪器，并将科研成果引入实验教学中，通过大型仪器实验教学，能够更好地激发学生的学习热情、培养学生的创新意识并锻炼学生动手实践的能力，可以为学生今后从事科研工作奠定良好基础。

本实验项目是在前期科研课题研究的基础上，根据分析化学课程实验教学任务和课时的安排，进行的实验内容的设置。一般分析化学中含量测定方法学考察内容包括：线性关系实验、精密度实验、稳定性实验、重复性实验和加样回收实验等，课题组在前期完成黄芩药材中黄芩苷和黄芩素的含量测定方法研究中，进行了完整的方法学研究，表明本法稳定、可靠。本实验因课时限制，在完成教学任务，保证教学质量的基础上，故只选择了方法学考察中线性关系作为实验内容。