环状RNA circ0023033及其靶基因在肺癌中的表达及诊断标志物意义

曹金秀 江雁琼 孙嘉

广州医科大学附属第五医院（广州510700）

肺癌在最近几十年里逐渐成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，伴随医学技术的不断发展，肺癌诊断和治疗已取得了很大的进步，但是患者的5年生存率仍然很低。大量的研究表明［1］，肺癌发病是一个多基因参与、多步骤的复杂病变过程，先是产生组织学上可以辨认的癌前病变，最后导致侵袭性肿瘤产生。肺癌的危险因素包括接触到的环境或职业致癌物，如汽车尾气、芳香化合物、石棉、砷、吸入的放射性物质等。尽管越来越多的肺癌危险因素已经被明确，但是其发生发展的机制仍不清楚。随着非编码RNA研究的不断深入，人们发现其在肺癌的发生发展过程中具有十分重要的作用。环状RNA（circular RNA，cir⁃cRNA）是一类新兴的非编码RNA分子，与传统的线性RNA不同，circRNA的分子结构呈封闭环状，不含有5′和3′末端，不易被核酸内切酶降解，具有一定的组织特异性。目前，对于circRNA作为肺癌标志物的研究报道较少。研究报道［2］hsa_cir⁃cRNA_100855为鼻咽癌circRNA芯片中显著高表达的基因，且hsa_circRNA_100855可作为鼻咽癌新的非编码RNA标志物。经GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）及circBase数据库（http：//www.circbase.org/）的 查 找 及 分 析 可 知 ，hsa_cir⁃cRNA_100855与 has_circ_0023033为同一个cir⁃cRNA，简称circ0023033。本研究主要寻找鼻咽癌新的circRNA标志物在同为呼吸系统肿瘤肺癌中的表达，探究其是否具备作为肺癌诊断标志物的潜力。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与细胞

1.1.1 主要仪器 超净工作台（1300 Series A2，Thermo Scientific），CO2细胞培养箱（Thermo Scien⁃tific），-80℃超低温冰箱（Thermo Scientific），液氮罐（Thermo Scientific），电热恒温水浴箱（苏州长风），制冰机（SM⁃F123 SANYO），倒置显微镜（Nikon），冰箱（Haier，Samsung），AB⁃7500实时PCR仪（Applied Biosystems），BG⁃thermo RT恒温仪（BAYgene）ND⁃1000紫外/可见分光光度计（Nano⁃drop Tecnologies）。

1.1.2 主要试剂 MEM培养基、DMEM培养基、RPMI⁃1640培养基、胎牛血清、DMSO、胰蛋白酶、青⁃链霉素双抗（Gibco），TRIzol裂解液（Invitro⁃gen），GoScript Reverse Transcription System、GoTaq qRCR Master Mix（Promega），microRNA 试 剂 盒（GeneCopoeia）。

1.1.3 细胞系 人永生化支气管黏膜上皮细胞（BEAS⁃2B），人肺癌细胞（H661、H1299、SK⁃MES⁃1）来自广州伯信生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BEAS⁃2B细胞使用含10%胎牛血清和1%青⁃链霉素双抗的DMEM培养基培养，H661和H1299细胞使用含10%胎牛血清和1%青⁃链霉素双抗的 RPMI⁃1640 培养基培养，SK⁃MES⁃1细胞使用含10%胎牛血清和1%青⁃链霉素双抗的MEM培养基培养。培养条件为37℃、5%CO2培养箱正常培养。当细胞融合度达到80%左右时，使用胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 常规细胞RNA提取 收集细胞后使用TRIzol进行裂解后，按照试剂盒说明书提取总RNA，而后使用Nanodrop⁃1000紫外/可见分光光度计测定RNA浓度，以及OD260/OD280，OD260/OD230的比值，将RNA分装保存于-80℃，备用。

1.2.3 逆转录与荧光定量PCR 检测circRNA和mRNA使用GoScript Reverse Transcription System试剂盒进行逆转录，严格执行操作说明书，每个样的总RNA量为200 ng。荧光定量PCR使用GoTaq qRCR Master Mix试剂盒，内参基因为β⁃actin，总反应体系为20 μL。miRNA使用miRNA试剂盒进行逆转录和荧光定量PCR，内参基因为U6，总反应体系为25 μL。

基因引物均由Life公司合成，其中circRNA根据其头尾拼接位点设计特异性引物。本研究涉及的基因引物序列见表1、2。

表1 circRNA、mRNA及内参基因引物序列Tab.1 Primer sequence of circRNA，mRNA and internal reference gene

1.2.4 生物信息学分析 使用RegRNA（http：//re⁃grna.mbc.nctu.edu.tw/）预测与 circ0023033 结合的miRNA，使用 Targetscan（http：//www.targetscan.org/）预测miRNA下游的mRNA。

1.3 统计学方法 所有试验至少重复3次，结果使用2^⁃ΔΔCt法表示基因的相对表达量，ΔΔCt=（Ct目的基因⁃Ct内参）处理组⁃（Ct目的基因⁃Ct内参）对照组。目的基因相对表达量（处理vs对照）=2^⁃ΔΔCt。数据采用 SPSS 22.0 进行统计学分析，试验数据以均数±标准差表示。两组间比较，满足正态分布且方差齐的采用双侧Student'st检验，双侧检验以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 circ0023033在不同肺癌细胞株中低表达利用circ0023033的特异性引物在BEAS⁃2B细胞及不同肺癌细胞（H661、H1299、SK⁃MES⁃1）中进行检测发现，circ0023033在H661、H1299、SK⁃MES⁃1细胞中高表达，在H1299细胞中差异表达最显著。差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

表2 miRNA引物序列Tab.2 Primer sequence of miRNA

图1 circ0023033在不同肺癌细胞中相对表达量Fig.1 Relative expression of circ0023033 in different lung cancer cells

2.2 circ0023033结合的多个miRNA在肺癌细胞中的表达 选择了18个miRNA，在BEAS⁃2B细胞及肺癌细胞H1299中进行检测发现，与BEAS⁃2B细胞进行比较，14个miRNA（miR⁃1182，miR⁃143，miR⁃2115，miR⁃4252，miR⁃4318，miR⁃516b，miR⁃93，miR⁃1256，miR⁃181a⁃2，miR⁃4299，miR⁃432，miR⁃520f，miR⁃128，miR⁃433）在H1299细胞中低表达，4个miRNA在H1299细胞中高表达。差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 生物信息学分析 通过生物信息学分析网站RegRNA，预测到与circ0023033结合的多个miR⁃NA。经查阅相关文献预测到的结合强度选择miR⁃143，运用生物信息学分析网站Targetscan预测其靶向的mRNA。在预测的mRNA中选择了4个肿瘤诊断标志物进行进一步检测研究。见图3。

图2 miRNA在肺癌细胞中相对表达量Fig.2 Relative expression of miRNA in lung cancer cells

2.4 circ0023033经miRNA靶向的多个肿瘤诊断标志物mRNA在肺癌细胞中的表达 通过对miR⁃143靶向mRNA进行筛选后，选择了其中4个肿瘤标志物（BCL2、KRAS、SMAD3、MAPK1），运用RT⁃qPCR进行检测发现：与BEAS⁃2B细胞进行比较，BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1的mRNA在H1299细胞中均显著高表达，这与4种肿瘤标志物本身的功能一致。差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近些年来其发病率呈现逐渐上升态势。目前肺癌的治疗手段主要为手术切除和常规放/化学治疗，患者预后十分严峻，5年生存率仅为11%。另一方面，由于缺少早期诊断的依据，肺癌患者确诊时肿瘤细胞往往已经发生了转移，这也是导致肺癌患者预后不良的主要因素。越来越多的研究报道表明［3］，基因表达与调控功能异常是肺癌发生和发展的内因和基础。其中非编码RNA的表达异常与肺癌的发生发展有着密切的关系。JIANG等［4］报道hsa_circ_0007385可以促进非小细胞肺癌（NSCLC）的发生和发展。

图3 生物信息学分析Fig.3 Bioinformatics analysis

图4 mRNA在肺癌细胞中相对表达量Fig.4 The relative expression of mRNA in lung cancer cells

circRNA的研究虽然目前仍处于起步阶段，但是其具有非常重要的生物学功能。大量的研究报道表明［5］，circRNA几乎参与了整个生物过程，其在转录、翻译以及反转录过程中均发挥了不容忽视的作用。circRNA不仅在生物过程中发挥作用，还参与了多种疾病的发生发展。众多研究表明［6］，circRNA在许多肿瘤组织与其癌旁组织中的表达具有特异性，因而具有作为新一类肿瘤标志物的潜力。YU等［7］报道circRNAcSMARCA5可充当 miR⁃17⁃3p 和 miR⁃181b⁃5p“海绵”，进而调控TIMP3的表达，最终抑制肝癌发生发展。ZHUANG等［8］报道的circRNA_0005836在活动性肺结核患者外周血单核细胞中明显下调，可以作为活动性肺结核的新的诊断标志物和治疗靶点。本研究从文献查找到的鼻咽癌circRNA芯片中高表达的circ0023033入手，探究其在肺癌细胞中的作用。通过在不同肺癌细胞株中检测发现，circ0023033均为高表达，尤以H1299细胞中最为显著，提示该基因可能具有癌基因的作用。为进一步探究circ0023033在肺癌细胞中如何发挥癌基因的作用，笔者使用生物信息学网站预测到了其下游靶向与肿瘤相关的18个miRNA。经RT⁃qPCR验证发现，14个miRNA在H1299细胞中低表达，4个miRNA 高表达。进一步查阅文献［9⁃10］结合预测到的结合强度，最终选取miR⁃143进行下一步探究。而后笔者经生物信息学网址预测到其下游靶向的4个mRNA，经RT⁃qPCR验证发现，BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1在H1299细胞中均显著高表达，这与文献报道中4种肿瘤标志物本身的功能一致［11⁃14］。笔者分析原因认为，circ0023033在肺癌细胞中高表达之后，对其靶向的miRNA吸附作用增强，导致其靶向的miR⁃143表达下调，miR⁃143下游靶向的BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1表达上调。

circRNA作为肺癌标志物的研究报道较少，本研究通过对circ0023033在肺癌细胞中的表达和其对下游靶基因的影响检测发现，circ0023033具备作为新的肺癌诊断标志物能力，也为进一步探究肺癌诊断方法提供了新的线索。