miR⁃17⁃5p在胶质瘤细胞中的作用机制

李城 李昌熙 王大新 戴燕 金世光

江苏省苏北人民医院1疼痛科，2医学实验研究中心（江苏扬州225001）

神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，有术后致残率高、复发率高、易出现侵袭转移、难以与周围组织分清界限、进展迅速、癫痫发生率高等特点，对多种治疗方案具有高耐受性［1-3］。恶性肿瘤患者中有15%～25%会发生脑转移，其中未治疗患者生存期仅为1个月左右［4-5］。miR⁃17⁃5p在肝癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等中的功能已经文献报道［6-10］，miR⁃17⁃5p在肝癌中通过激活MAPK信号通路促进其增殖和迁移［6］，在宫颈癌中通过靶向TP53INP1抑制细胞增殖和促进细胞凋亡［7］，而其在胶质瘤中的作用尚不清楚。因此，本课题就miR⁃17⁃5p对胶质瘤的增殖迁移的作用机制，以及其是否通过参与P13K⁃AKT信号通路调节胶质瘤细胞对放疗的敏感性进行研究。以期为今后恶性胶质瘤放射治疗联合基因治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂 0.25%胰蛋白酶消化液，RNA酶，10%胎牛血清H⁃DMEM培养液，胶质瘤细胞系U87⁃2M1、SW1088，pSilencer2.1⁃U6 neo试剂盒（Ambion，美国）。

1.2 仪器 qRT⁃PCR仪（ABI StepOne Plus），流式细胞仪（MoFlo XDP），生物安全柜 1205A（FORMA），CO2培养箱（FORMA），倒置显微镜 IX70（OLYM⁃PUS）。

1.3 实验方法

1.3.1 miRNA芯片技术进行检测miR⁃17⁃5p在胶质瘤中表达 针对3对同一患者来源的胶质瘤组织及其邻近的癌旁正常组织中的miRNA表达水平，用miRNA芯片技术进行检测。

1.3.2 qRT⁃PCR检测miR⁃17⁃5p在胶质瘤细胞中的表达 提取6株胶质瘤细胞系（U87⁃2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和1株正常星状细胞（NHA）的总RNA，然后反转加尾，利用qRT⁃PCR检测胶质瘤细胞系（U87⁃2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和正常星状细胞（NHA）中miR⁃17⁃5p的表达水平。

1.3.3 qRT⁃PCR检测过表达miR⁃17⁃5p后胶质瘤细胞中miR⁃17⁃5p的表达 向胶质瘤细胞系U87⁃2M1中转染miR⁃17⁃5p mimics 36～ 48 h后，利用qRT⁃PCR检测miR⁃17⁃5p的表达水平。

1.3.4 克隆形成实验检测胶质瘤细胞克隆形成能力 向胶质瘤细胞系SW1088中分别转染mimics Control，miR⁃17⁃5p mimics，ASO⁃NC，miR⁃17⁃5p⁃ASO（miRNA拮抗剂），36～48 h后进行平板克隆形成实验，第14天结束，计数6孔板中形成克隆的数目，观察miR⁃17⁃5p对胶质瘤细胞克隆形成能力的影响。

1.3.5 Transwell检测miR⁃17⁃5p影像胶质瘤细胞的迁移能力 在胶质瘤细胞U87⁃2M1和SW1088中分别转染 miR⁃17⁃5p mimics或miR⁃17⁃5p ASO，36 h后进行transwell实验，计数通过膜的细胞数平均值。

1.3.6 流式凋亡检测miR⁃17⁃5p影像胶质瘤细胞对放疗的敏感性 将胶质瘤细胞SW1088分为6组，3组转染mimics Control，3组转染miR⁃17⁃5p mimics，转染24 h后，分别将一组mimics control和一组miR⁃17⁃5p mimics用0、4、6 Gy的X线照射（源皮距为100 cm，剂量率为320 cGy/min，瓦里安600 C，加速器6 MV X线照射），每组的每个剂量点均重复3次，然后用Annexin V⁃PI双染色法验证miR⁃17⁃5p对胶质瘤细胞的放疗增敏性的调节。

1.4 统计学方法 应用SPSS12.0统计分析软件，统计学处理采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因芯片结果显示miR⁃17⁃5p在胶质瘤中高表达 芯片结果显示与相应的癌旁正常组织相比，miR⁃17⁃5p在3个胶质瘤组织样本中表达水平相对比较高（P＜0.05），芯片结果见图1。

图1 基因芯片检测胶质瘤组织中miRNA的表达变化Fig.1 The miRNA expression differences observed in glioma cancer cells obtained by gene chip detection analysis

2.2 qRT⁃PCR检测miR⁃17⁃5p在胶质瘤细胞中的表达 检测结果表明，与正常星状细胞（NHA）相比，miR⁃17⁃5p在胶质瘤细胞系（U87⁃2M1、SW1088、U87、T98G）中高表达，其中胶质瘤细胞系U87⁃2M1、SW1088表达量比较高，这与基因芯片结果一致，结果见图2，其中用U6作为内参。接下来细胞实验采用胶质瘤系U87⁃2M1、SW1088。

图2 qRT⁃PCR检测胶质瘤细胞系和正常星状细胞系中miR⁃17⁃5p的表达水平Fig.2 The expression level of miR⁃17⁃5p in glioma cancer cells and normal astrocytes analyzed by qRT⁃PCR

2.3 qRT⁃PCR检测过表达miR⁃17⁃5p后，在胶质瘤细胞中miR⁃17⁃5p的表达 检测结果表明，在胶质瘤细胞（U87⁃2M1）中过表达miR⁃17⁃5p后，miR⁃17⁃5p的表达水平升高，结果见图3。

图3 qRT⁃PCR检测胶质瘤细胞中miR⁃17⁃5p的表达水平（U6作内参）Fig.3 The expression level of miR⁃17⁃5p in glioma cancer cells assessed by qRT⁃PCR（U6 as control）

2.4 克隆形成实验表明miR⁃17⁃5p促进胶质瘤细胞的增殖 实验结果发现过表达miR⁃17⁃5p增加胶质瘤细胞SW1088的克隆形成能力，而转染miR⁃17⁃5p⁃ASO将会降低胶质瘤细胞SW1088的克隆形成能力。结果如图4所示，转染后48 h检测的不同表达水平的miR⁃17⁃5p对SW1088细胞集落形成能力的影响（P＜0.05）。

图4 miR⁃17⁃5p对胶质瘤细胞SW1088集落形成能力的影响Fig.4 The effect of miR⁃17⁃5p on the colony formation of glioma cancer cells SW1088

2.5 Transwell表明miR⁃17⁃5p促进胶质瘤细胞的侵袭 转染miR⁃17⁃5p mimics后，细胞侵袭能力与对照组相比升高；转染miR⁃17⁃5p ASO后，细胞侵袭能力与对照组相比降低，结果见图5。可见miR⁃17⁃5p可以促进胶质瘤细胞U87⁃2M1和SW1088的侵袭能力。

2.6 流式凋亡检测表明miR⁃17⁃5p可以降低胶质瘤细胞对放疗的敏感性 分析流式细胞检测结果发现转染mimics control组随着X线照射剂量的增加（0、4、6 Gy），胶质瘤细胞系SW1088的细胞凋亡数目百分比依次增加，0 Gy的X射线照射时凋亡细胞百分数是1.38%，4 Gy的X射线照射时凋亡细胞百分数是14.25%，6 Gy的X射线照射时凋亡细胞百分数是32.92%。而转染miR⁃17⁃5p mimics组随着X线照射剂量的增加（0、4、6 Gy），胶质瘤细胞系SW1088的细胞凋亡数目百分比也依次增加，0 Gy的X射线照射时凋亡细胞百分数是0.78%，4 Gy的X射线照射时凋亡细胞百分数是7.43%，6 Gy的X射线照射时凋亡细胞百分数是17.34%。而相同剂量X射线照射时，转染miR⁃17⁃5p组胶质瘤细胞SW1088的凋亡细胞百分比显著低于转染mimics control组。这些结果表明miR⁃17⁃5p可以降低胶质瘤细胞SW1088对放疗的敏感性。

图5 miR⁃17⁃5p对胶质瘤细胞U87⁃2M1和SW1088侵袭能力的影响Fig.5 The effect of miR⁃17⁃5p on the invasion and metastasis of U87⁃2M1 and Sw1088 glioma cancer cells

图6 流式检测miR⁃17⁃5p对放射敏感性的检测Fig.6 The FACS analysis of radio⁃sensitivity of miR⁃17⁃5

3 讨论

脑胶质瘤是颅内最常见的呈浸润性生长的恶性肿瘤，占全部颅内肿瘤的40%～50%［11］，胶质瘤临床治疗的难点主要是由于其临床表现和症状、影像学或形态学预警及其浸润性没有显著的特征［12-13］。目前越来越多的文献报道，miRNAs参与细胞的增殖、凋亡、细胞分化等多种生物学行为［14］，同时也可参与恶性肿瘤的侵袭、迁移、肿瘤微环境的调节以及肿瘤干细胞的调控等［15-18］。

本实验利用miRNA芯片技术进行检测过程中发现miR⁃17⁃5p在胶质瘤组织样本中表达水平相对比较高，笔者预测miR⁃17⁃5p与胶质瘤的发生与发展有关。因此，为了进一步验证设想进行了qRT⁃PCR检测胶质瘤细胞系（U87⁃2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和正常星状细胞（NHA）中miR⁃17⁃5p的表达水平。结果表明胶质瘤细胞U87⁃2M1、SW1088中的miR⁃17⁃5p的表达水平明显增高。qRT⁃PCR检测过表达miR⁃17⁃5p后，在胶质瘤细胞中miR⁃17⁃5p的表达水平升高。通过克隆形成实验和Transwell实验可以看出miR⁃17⁃5p具有增强胶质瘤细胞的生长和迁移作用，反之降低生长和迁移能力。同时，通过流式细胞仪检测了miR⁃17⁃5p对胶质瘤细胞中放疗敏感性的作用，结果显示miR⁃17⁃5p可以降低胶质瘤细胞SW1088对放疗的增敏性调节。本实验探讨证实了以下两个个方面的科学问题：（1）证实miR⁃17⁃5p促进胶质瘤细胞增殖和迁移；（2）确立miR⁃17⁃5p与胶质瘤对放疗敏感性之间的关系。miRNA发挥作用存在一定的复杂性，同一种miRNA可能同时影响多个靶mRNA，而同一种靶mRNA也可能同时被多个miRNA靶定。因此，在分析这些靶基因时，可能会出现单一靶基因在体外分析时作用相对明显，但是体内实验效果并不理想等特点。此时可以考虑多个基因联合作用并详细分析在体内情况下，是哪些因素起主导作用，同时考虑体内其他miRNA作用的代偿作用，从而客观分析miR⁃17⁃5p调节胶质瘤细胞增殖迁移和放疗敏感性的具体分子机制。

本实验研究结果表明miR⁃17⁃5p在胶质瘤细胞的发生和发展过程中扮演着重要的角色，同时与胶质瘤细胞的放疗敏感性有关。但具体分子机制尚不明确，在下一步工作中需深入探讨胶质瘤发生和发展过程中的信号通路，确定miR⁃17⁃5p作用的直接靶基因，明确miR⁃17⁃5p在信号通路中的作用机制。