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葡萄糖对滋养细胞内脂素表达的影响

2018-07-27张艳红尹晓茜霍琰王润芳邢邯英刘素新

实用医学杂志 2018年14期
关键词:高糖葡萄糖引物

张艳红 尹晓茜 霍琰 王润芳 邢邯英 刘素新

河北省人民医院1产科,3临研中心(石家庄 050051);2河北北方学院研究生院(河北张家口 075000)

内脂素(visfatin)是一种主要由胎盘和内脏脂肪组织表达和分泌的脂肪细胞因子,可参与炎症反应的调节,参与糖脂代谢,还与胰岛素抵抗(IR)和妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)发病密切相关。然而GDM患者visfatin水平升高或降低,及visfatin在GDM发病机制中的作用仍存在争议。

过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR⁃γ)是一种细胞核受体,国外一项研究表明,在人巨噬细胞中PPAR⁃γ参与诱导visfatin基因表达[1],而在滋养细胞PPAR⁃γ是否参与visfatin表达的调节,国内外未见研究和报道。c⁃Jun氨基末端激酶(JNK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶,能够被多种细胞因子和应激激活,如:紫外线照射、内质网应激、氧化应激、炎症因子等,被认为是联系炎症和IR的重要信号转导分子[2]。本研究以葡萄糖作用于人滋养细胞(BeWo)观察visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK表达的变化,探讨葡萄糖对visfatin表达的调节及是否通过PPAR⁃γ和JNK通路,旨在发现GDM发病的分子机制和寻找GDM的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验分组及方案 接种BeWo细胞(购自中国协和医院细胞中心)于六孔板中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养,于对数生长期分别加入不同浓度的葡萄糖(0,5.5,10,30 mmol/L,Sigma公司)作用48 h,提取RNA,RT⁃PCR检测细胞visfatin、PPAR⁃γ mRNA表达;接种BeWo细胞于25 cm2培养瓶中培养,于对数生长期加入不同浓度的葡萄糖作用48 h,提取总蛋白,Western⁃blot检测细胞visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK蛋白表达;留取干预后的培养液,ELISA检测visfatin的分泌水平。

1.2 检测指标和方法

1.2.1 实时定量聚合酶链反应(RT⁃PCR)检测各组细胞visfatin、PPAR⁃γ mRNA表达 葡萄糖作用48 h后,每孔加入1 mL Trizol(Invitrogen公司)提取总RNA,各加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水40 μL,分别测定吸光度A260和A280值计算纯度及浓度,A260/A280均在 1.8 ~ 2.0;按 FastQuant RT Kit试剂盒(TIANGEN公司)进行反转录;参照试剂盒说明建立PCR反应体系,PowerUpTMSYBR Green Master Mix(ABI公司)10 μL,Forward Primer 1 μL,Reverse Primer 1 μL,cDNA 8 μL,共20 μL反应体系,GAP⁃DH正向引物:5′⁃TGAACGGGAAGCTCACTG⁃3′,反向引物:5′⁃GCTTCACCACCTTCTTGATG⁃3′;PPAR⁃γ 正向引物:5′⁃GCCCTTCACTACTGTTGACTTCT⁃3′,反向引物:5′⁃CAGGCTCCACTTTGATTGC⁃3′;visfatin 正向引物:5′⁃TTGCCTTCGGTTCTGGTGGA⁃3′,反向引物:5′⁃AATTCCCTGCTGGCGTCCTA⁃3′采用ABI公司7300型荧光定量PCR仪检测visfatin、PPAR⁃γ mRNA相对表达量RQ值。

1.2.2 蛋白印迹(Western blot)法检测各组细胞中visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK蛋白表达 用预冷的PBS洗涤干预好的贴壁细胞2次,细胞刮收集细胞至离心管中,离心后加入RIPA裂解液(含1%的PMSF和蛋白磷酸酶抑制剂),4℃裂解1 h,12 000 r/min,4℃离心30 min,BCA法测蛋白浓度。取30 μg蛋白进行10%聚丙烯凝胶电泳,湿法电转移至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2~4 h,按合适比例加入一抗稀释液(GAPDH抗体1∶5 000,visfatin抗体1∶250,PPAR⁃γ抗体1∶1 000,JNK 及p⁃JNK抗体1∶500稀释,各抗体属性均为兔抗),4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜后加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(SAB公司),室温孵育1 h,最后用ECL化学发光法检测各蛋白表达。图片灰度值采用IMAGE J软件分析,以目的蛋白灰度值除以内参灰度值以校正误差,所得结果代表该目的蛋白相对含量。抗体visfatin、PPAR⁃γ、JNK、p⁃JNK由Abcam公司提供。内参抗体GAPDH由Bioworld公司提供。

1.2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液中visfatin分泌水平 按人visfatin ELISA试剂盒(ImmunoWay Biotechnology公司)说明检测visfatin的分泌水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0软件进行数据的统计学处理,结果以表示。进行正态性和方差齐性检验,各组间变量比较,采用单因素方差分析和 Student⁃Newman⁃Keuls post⁃hoc 两两检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖对BeWo细胞visfatin、PPAR⁃γ mRNA表达的影响 与对照组相比,不同浓度的葡萄糖作用于BeWo细胞48 h后,visfatin mRNA表达均升高,呈浓度依赖性;PPAR⁃γ mRNA表达,仅30 mmol/L组明显升高(P<0.05)。见图1。相关性分析表明,visfatin与PPAR⁃γ mRNA表达正相关(r=0.686,P=0.014)。

图1 葡萄糖作用48 h后visfatin和PPAR⁃γ mRNA表达结果Fig.1 The mRNA expression of visfatin and PPAR⁃γ affected by glucose for 48 h

2.2 不同浓度葡萄糖对BeWo细胞visfatin、PPAR⁃γ、p⁃JNK蛋白表达的影响 不同浓度葡萄糖作用于BeWo细胞48 h后,visfatin蛋白表达升高,呈浓度依赖性;PPAR⁃γ蛋白表达在不同浓度组呈降低趋势,但差异均无统计学意义;葡萄糖对JNK蛋白表达及磷酸化无明显影响。见图2。

2.3 不同浓度葡萄糖对BeWo细胞visfatin分泌的影响 BeWo细胞visfatin分泌水平较低,与对照组比较,各浓度葡萄糖组其分泌均无显著差异。见图3。

图2 各组细胞visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK蛋白表达结果Fig.2 The protein expression of visfatin、PPAR⁃γ and p⁃JNK in BeWo cells

图3 各浓度组visfatin分泌水平Fig.3 The secretion levels of visfatin in all groups

3 讨论

多数研究表明[3-5],GDM患者visfatin水平升高。有学者认为GDM患者visfatin表达降低[6]。另有研究[7]显示,GDM患者孕中期血清visfatin水平无变化。虽然存在争议,但均认为visfatin与GDM相关,但其具体作用机制还未阐明。关于visfatin与GDM的关系,目前国内外绝大多数都基于体内研究,本研究以BeWo细胞为模型,在细胞水平探讨葡萄糖对visfatin表达的影响及机制。该细胞系来源于人胎盘绒毛膜癌细胞,各项主要特征与滋养细胞类似,可在细胞水平提供胎盘的综合信息[7]。

本研究首次以葡萄糖干预模拟GDM患者高血糖模型,结果显示葡萄糖可促进BeWo细胞visfatin基因和蛋白表达,呈浓度依赖性,而对其分泌无明显影响。国内马瑶等[8]研究表明TNF⁃α作用于BeWo细胞后,其胞内visfatin表达降低,而胞外分泌增加,呈剂量依赖性,从而认为visfatin主要作为炎症因子参与GDM发病。本实验葡萄糖对BeWo细胞visfatin分泌无明显影响,且其分泌水平较低,表明高糖不能直接诱导visfatin分泌,虽然可促进visfatin基因和蛋白表达,但对JNK蛋白表达及磷酸化无明显影响,从而证明高糖不能通过JNK通路参与对BeWo细胞visfatin表达的调节。提示GDM患者JNK介导炎症和IR的机制,不能由高糖直接引起,可能是因肥胖和GDM孕妇体内IL⁃6、TNF⁃α等炎症因子水平升高,这些炎症因子通过激活JNK通路参与IR,还需今后进一步研究。

最近,有研究[9]认为胞外内脂素发挥促炎和致动脉粥样硬化作用,而其胞内作用与之相反,其胞内外功能的不同可能与胞内外烟酰胺腺嘌呤二核苷(NAD)的作用有关,胞内NAD可激活脱乙酰酶(sirtuins),通过组蛋白的脱乙酰作用调节靶基因转录,而胞外NAD可结合并激活胞外受体从而引发炎症反应。Visfatin也叫烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt),是NAD生物合成的限速酶,NAD是一种重要的辅酶,参与多种氧化还原反应,通过电子转移参与ATP生成,对维持机体能量代谢起重要作用[10]。NAD还可通过调节依赖NAD的sirtuin⁃1活性上调脂联素的生物合成,进而改善肝脏、脂肪组织和骨骼肌对胰岛素的敏感性[11-12]。Sirtuin⁃1还可增加由葡萄糖刺激的胰腺β细胞胰岛素分泌[13],当visfatin表达降低时可损害胰岛素分泌,进而使血糖调节受损。本研究显示高糖状态下,BeWo细胞visfatin表达增加,可能通过反馈机制增加胰岛素分泌,维持血糖平衡。此外,visfatin还具有胰岛素模拟活性,能与胰岛素受体结合发挥降糖作用[5,14-15]。

本研究表明,高糖主要促进BeWo细胞内visfatin表达,而对其分泌无明显影响,由此推测GDM患者胎盘滋养细胞visfatin表达上调主要对维持滋养细胞能量代谢和胎盘功能起重要作用,还可通过调节NAD的合成和sirtuin⁃1的活性维持血糖平衡,作为GDM的保护因子。本研究发现高糖促进BeWo细胞visfatin和PPAR⁃γ mRNA表达,且二者表达正相关。国外一项研究[1]表明,在人巨噬细胞visfatin是PPAR⁃γ的一个靶基因,其配体可以PPAR⁃γ依赖方式上调visfatin的表达。因此,噻唑烷二酮类药物可通过激活PPAR⁃γ来上调visfatin表达,可能为GDM的预防和治疗提供新的靶点。

综上所述,本研究表明高糖可促进BeWo细胞visfatin基因和蛋白表达,PPAR⁃γ可能在转录水平上调visfatin的表达,但其对visfatin及糖代谢的具体作用机制尚需进一步研究。

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