上调海马miR⁃107水平改善阿尔茨海默病模型鼠学习记忆损伤

王雪银 李宜培

河南医学高等专科学校微生物与免疫学教研室（郑州 451191）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码的小分子RNA，能够通过和靶基因mRNA的3′UTR段结合抑制其蛋白质的表达发挥作用［1］。人源miR⁃107最早被证实作为一个关键的调控因子参与糖的代谢［2］。近来的研究表明miR⁃107在早期的阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）患者脑中表达下降，与AD特征性的病理特征神经纤维缠结和炎性斑块的水平呈负相关［3］，并且miR⁃107还能通过调控淀粉样蛋白剪切酶BACE1的功能，加剧AD患者的记忆力损伤［4］。此外，β淀粉样蛋白（amyloid β⁃protein，Aβ）转基因小鼠的研究证实miR⁃107参与了丝氨酸蛋白水平的调节和棒状结构的形成［5］。以上的研究结果说明miR⁃107可能参与了AD的病理过程，影响了其学习记忆能力，但是具体的分子机制现在还不清楚。为了探讨miR⁃107在AD病理过程中的具体机制以及对AD导致的学习记忆障碍的作用，本研究利用立体定位注射系统在AD模型鼠海马区上调miR⁃107的表达水平，并检测其对AD模型鼠突触相关蛋白NMDA受体2B（NR2B）和谷氨酸受体1（GluR1）以及学习记忆损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 miR⁃107表达慢病毒颗粒有本室包装和保存。293FT（人胚肾细胞）购自美国ATCC中心，由本室传代并保存。IMDM（含GlutaMAX）、FBS、MEM Non⁃Essential Amino Acids（NEAA）、GlutaMAX I、TrypLE express、双抗、Neurobasal、B27购自Gbico公司，NR2B一抗、GAPDH抗体购自Ab⁃cam公司。BCA蛋白测定试剂盒，免疫印迹的二抗Odyssey Second antibody购自Pierce公司。硝酸纤维素膜（NC）购自Hybond公司，转基因小鼠垫料食物购自北京华阜康。AD模型鼠由本室饲养保存。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及病毒注射 选取6～8个月龄的雄性AD模型鼠，实验动物分为miR⁃107表达病毒组（病毒组）和空载体病毒组（对照组）。利用脑立体定位技术，采用微量注射系统将病毒颗粒注射AD鼠双侧海马区域，2周后进行后续实验。

1.2.2 定量PCR Trizol法提取AD模型鼠海马组织的总RNA，超微量全波长分光光度测RNA浓度及纯度，1%的琼脂糖凝胶电泳确定RNA形态之后，用 All⁃in⁃One First⁃strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成 mRNA 的 cDNA，然后用 All⁃in⁃One miRNA qRT⁃PCR Detection Kit进行Real Time PCR检测miRNA的表达水平，以U6 snRNA为内参，2-ΔΔCT对样品进行基因表达分析。

1.2.3 Western blot 病毒感染2周后分别提取病毒组和对照组小鼠海马组织蛋白，常规处理蛋白样品后，取两组蛋白样品各30 μg进行12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离后的蛋白采用半干法电转移至硝酸纤维素膜，NR2B和GluR1的一抗4℃进行孵育过夜，二抗室温避光孵育，洗膜3次后Odensey激光红外扫描仪扫膜检测蛋白水平。

1.2.4 Morris水迷宫 病毒感染2周后，采用Morris水迷宫进行行为学检测空间学习记忆能力。实验时间为定位航行训练6 d，休息1 d，第7天空间搜索检测。设定潜伏期为90 s，定位航行阶段记录潜伏期，空间搜索阶段记录穿越平台次数。实验分组：实验动物分为两组，每组15只动物。病毒组为AD模型鼠海马区注射miR⁃107病毒；对照组为AD模型鼠海马区注射空载体对照病毒。

2 结果

2.1 慢病毒上调AD模型鼠海马区miR⁃107水平为了检测感染病毒后AD模型鼠的miR⁃107水平，利用定量PCR法检测了病毒感染2周后两组小鼠海马组织的miR⁃107的水平。定量PCR结果示，与对照组比较，病毒组AD鼠海马区miR⁃107的表达水平显著上调（图1）。上述结果证实可以通过海马区注射miR⁃107过表达慢病毒颗粒，有效地上调AD模型鼠脑内的miR⁃107水平。

图1 定量PCR法检测病毒感染后AD鼠海马区miR⁃107的表达水平Fig.1 The expression of miR⁃107 in hippocampus of AD mice was detected by quantitative PCR after virus infection

2.2 上调海马miR⁃107增加突触相关蛋白水平为了检测miR⁃107对AD模型鼠突触相关蛋白的影响，利用过表达病毒上调了海马区miR⁃107水平后，检测了NR2B和GluR1的表达水平，结果显示，与对照组相比，上调海马区miR⁃107水平后，病毒组AD模型鼠海马区NR2B和GluR1的蛋白水平显著上调（图2）。NR2B和GluR1的表达水平对于学习记忆的功能具有重要作用，所以上述结果提示增加的NR2B和GluR1可能参与miR⁃107影响学习记忆的分子机制。

2.3 上调miR⁃107减轻AD模型鼠学习记忆障碍 为了确认上调海马区miR⁃107水平对AD模型鼠学习记忆障碍的影响，利用Morris水迷宫的方法检测了病毒组和对照组AD模型鼠的空间学习记忆能力。结果显示，与对照组相比，上调海马区miR⁃107水平后，病毒组AD模型鼠在学习阶段的潜伏期显著缩短，说明其学习的能力明显增强（图3A）。而在穿越平台的次数检测中同样显示了记忆能力的明显改善，与对照组相比，病毒组AD模型鼠穿越平台的次数明显增加（图3B）。

图2 免疫印迹检测上调miR⁃107后NR2B、GluR1的表达水平Fig.2 The expression of NR2B and GluR1 were tested by Western blot after miR⁃107 was upregulated

图3 Morris水迷宫检测Tg2576小鼠空间学习记忆能力（n=15）Fig.3 The spatial learning and memory of Tg2576 mice detected by Morris water maze test

3 讨论

AD是一种极大危害人类健康的神经退行性疾病，主要临床表现为记忆障碍、人格和行为异常，最显著的病理变化包括神经纤维缠结［6］、淀粉样蛋白变性［7］、神经和血管的大量丢失［8］和血脑屏障完整性损伤［9］等。临床上一直缺乏有效的治疗药物，而各个研究机构开发的一系列新的有望改善AD病理变化的靶点药物，包括小分子的siRNA和miRNA药物［10］。

miRNA属于非编码RNA，其作用方式是和靶蛋白的mRNA 3′UTR端互补结合导致蛋白表达抑制或者mRNA降解，由于其能够通过调控多种蛋白质的表达水平而参与疾病的病理过程成为近年来研究的热点［11］。研究表明AD患者脑脊液中的部分miRNA的表达会发生明显的异常［12］。miRNA对AD发生发展的影响涉及到对APP、BACE1、神经元的凋亡等多环节的调控作用［13］。miR⁃107是一种富含于脑内组织的miRNA，在早期AD发病进展中在颞叶皮层灰质区表达活性降低，邻近大脑组织中神经元血小板的计数和神经元纤维缠结数的增加与miR⁃107的表达水平降低有关［14］。研究证实，AD病理过程重要的致病因子Aβ可通过降低miR⁃107的表达水平损伤血脑屏障的完整性［15］。上述结果提示miR⁃107可能通过影响AD的病理过程而调控其学习记忆的能力，但是具体的调控机制仍不清楚。

为了探讨miR⁃107对于AD模型鼠学习记忆损伤的影响，本研究通过立体定位系统，采用微量注射的方法通过miR⁃107表达病毒特异性的提高AD模型鼠海马区miR⁃107的表达水平。然后通过一系列的方法检测过表达miR⁃107对于AD模型鼠的影响。免疫印迹的结果提示过表达miR⁃107能够显著增加海马区突触相关蛋白NR2B和GluR1的水平，miRNA可以通过和目标基因的调控区序列或者调节一些转录因子的表达水平而改变相关蛋白的表达。本研究中没有获得miR⁃107直接调控NR2B和GluR1表达的证据，所以推测是通过调节某种转录因子的表达水平间接地上调了NR2B和GluR1的蛋白水平，这也将是笔者后续研究的主要内容。NR2B和GluR1均属于谷氨酸受体家族成员，能够通过影响突触传递和可塑性调控学习记忆［16］，所以上调的NR2B和GluR1水平可以改善小鼠的学习记忆能力［16］。水迷宫是检测小鼠学习记忆能力的最常用实验方法，本研究的结果表明病毒组的AD小鼠在定位航行阶段的潜伏期明显缩短，证明该组小鼠的学习能力得到了改善，而在空间搜索阶段穿越平台位置的次数也显著增加，说明了其空间依赖的记忆能力得到了明显提高，具体的分子机制还有待于进一步的研究。国内外关于AD的研究大多数关注于减少能引起病理特征的β淀粉样蛋白和Tau蛋白，本研究通过改变脑内特定miRNA水平，提高突触相关蛋白的表达，最终改善了AD模型鼠的学习记忆能力。总之，本研究通过特异性上调AD模型鼠海马区的miR⁃107表达水平，增加了学习记忆相关蛋白NR2B和GluR1的水平，改善了AD模型鼠的空间学习记忆能力，为AD药物研发和临床治疗提供了新的思路。