山羊无角间性综合征(PIS)形成机制与鉴定方法研究进展

张少丽，王 珂，许 晗，彭 坤，闫海龙，曹馨元，蓝贤勇，潘传英*

(1.西北农林科技大学 创新实验学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

间性，即“雌雄同体”，是指在雌雄异体动物中偶尔出现的某些个体具有两性性腺或生殖器官的现象。山羊角型性状是山羊重要的经济性状之一，与有角山羊相比，无角山羊更好管理，不会对管理人员和其他山羊个体造成伤害，还减少了对皮毛的损伤和怀孕母羊因打斗引发流产的几率；此外，山羊角的生长会消耗一部分营养物质，故培育无角山羊可减少这部分营养的浪费。早在19世纪，研究人员就发现了无角山羊具有诸多优点，故采用在群体中选育无角个体来培育无角山羊品系。然而，随着时间的推移，逐渐发现无角品系中雌雄比例失衡，出现了间性个体比例上升的现象，后来称这种现象为山羊无角间性综合征(Polled Intersex Syndrome, PIS)[1]。对于PIS山羊，个体生殖系统畸形，体内激素分泌紊乱，不具有繁殖后代的能力且寿命较短，对于养羊业造成经济损失。为此，本文从无角间性山羊的形态学及解剖学特征、核型分析、PIS区域结构与功能，以及检测等方面进行阐述，并综述群体中筛选PIS山羊的方法，以期促进养羊业的发展。

1 间性山羊的形态与解剖特征

根据性腺不同，间性山羊可分为真间性与假间性，其中，真间性是指一个个体同时具有两种性腺(睾丸和卵巢，或包含睾丸和卵巢组织的两性腺体)，而假间性则是指在同一个体内只存在一种性腺(睾丸或卵巢)，但生殖器官的其他部分为两性形式[2]。基于此，无角间性山羊分为偏雄性无角间性山羊和偏雌性无角间性山羊。 偏雄性无角间性山羊具有雄性的生殖器官和性腺，但不一定发育完全；剖检可见雌性的部分生殖器官或者性腺。 偏雌性无角间性山羊外观可见雌性的生殖器官，但有不同程度的形态改变，它具有雌性的性腺；剖检可见雄性的部分生殖器官或者性腺。

2 间性山羊的核型特征

研究表明，间性山羊的性染色体包括4种类型:(1)60，XX或60，XY间性；(2)60，XX/60，XY嵌合或镶嵌间性；(3)60，XY/61，XXY嵌合间性；(4)59，XO/60，XX/61，XXX嵌合间性。根据间性的发生频率，第(1)种类型的间性占绝大多数，最为常见；第(2)种类型为散发性的，具有一定的偶然性，频率较低；第(3)、(4)种类型目前仅有1例报道[3]。1980年常洪通过对1660只初生羔羊性别进行统计提出，间性山羊遗传基础为雌性[4]。1982年Bongso认为，大多数间性山羊染色体组成为60XX，但也有60XX/XY嵌合体[5]。Vallenzasca等[6]发现2例有雄性生殖器官且尿道下裂的无角间性山羊，指出它们分别为60XX和60XX/XY嵌合体。Bongso等[5]对有角间性山羊血液、骨髓以及皮肤进行染色体核型分析，揭示60XX/XY嵌合体在有角间性山羊中的频率远大于其在无角间性山羊中的频率。Hamerton等[7]只在造血组织中发现染色体为60XX/XY嵌合体，且在不同组织之间XX细胞与XY细胞所含比例不同。Pailhoux等[8]对3只无角间性山羊的染色体组成及Y染色体筛选，排除了Y染色体易位和XX/XY嵌合现象。冯蜀举等[9]发现一例60XX/XY嵌合体真两性畸形间性山羊。陆建英等[10]在2例性畸形山羊中发现60XX/XY嵌合体。由此可见，大多数间性山羊性染色体都为60XX。

3 间性山羊的PIS区域结构与功能

从20世纪20年代起，无角山羊在畜牧业中越来越受欢迎，同时山羊的无角间性现象也引起了产业广泛关注。美国等饲养的萨能山羊、土根堡山羊、阿尔卑斯山羊、马拉哥山羊及巴西土种山羊等品种均出现了间性山羊，其发生频率在4%～15%之间[11]。在我国，亦发现国内饲养的萨能山羊、承德无角山羊、马头山羊中出现间性个体，其发生频率在3.82%～10.63%之间[9,12-15]。在20世纪前中期，美国和英国等学者发现间性山羊大多是无角的，有角间性山羊几乎不存在，并且无角间性山羊的遗传基础大多数是雌性[1]。1980年，我国西北农业大学常洪教授验证了以上观点[4]。利用系谱分析法探究间性性状与无角性状的关系，进而确定了间性是常染色体隐性遗传与无角性状紧密连锁[16]，Vaimand等[17]将无角间性综合征位点定位在1号染色体末端，随后，Schibler等[18]应用连锁不平衡分析和染色体步移技术成功地将其定位在山羊染色体1q43的100 kb范围内(图1a)。2001年，Pailhoux[19]克隆得到一段长约11.7 kb缺失片段(AF404302)，并发现该片段缺失导致了山羊PIS[16]。

图1 山羊PIS结构及检测[16，29，31]a.PIS区域位于1号染色体1q43区；b.FOXL2、PFOXic、PISRT1和PIS区的位置关系及PIS区域的内部结构；c.山羊基因型为PIS+/+、PIS-/+和PIS-/-时的电泳模式图Fig.1 Structure and detection of goat PIS

最新研究表明，PIS区域突变会影响生殖细胞的支持细胞[20]，并且可以影响至少三个与性别相关主要基因-FOXL2 (ForkheadboxL2)、PISRT1 (PIS-regulatedtranscript1) 和PFOXic(promoterFOXL2inversecomplementery)的表达。FOXL2是一种卵巢分化相关基因，与人类眼睑下垂疵皮综合征相关，具有编码蛋白质的功能，是雌性山羊的性别决定基因[21]。该基因在卵泡细胞与初级卵泡颗粒细胞中高表达[22]，其突变不仅会导致动物出现卵巢早衰，还会导致人类心房间隔缺损(Atrial Septal Defect, ASD)[23]；该基因敲除的成年雌性小鼠会发生卵巢退化，而后又发育成了睾丸，表明FOXL2还具有阻止睾丸形成的功能[24]；当FOXL2缺失时，可上调SOX9的表达[25]。PISRT1基因转录一段1.5 kb的mRNA，该mRNA不含开放阅读框，是一种抗睾丸因子，可抑制SOX9基因的表达[26]。而SOX9是一种主要调节睾丸分化的因子[27]，是雄性生殖发育过程中不可缺少的，由此推测PISRT1基因与性别发育密切相关。PFOXic基因位于FOXL2基因启动子区并与之反向互补，其中含有开放阅读框[20]，它可表达由163个氨基酸组成的既定蛋白质，有一个双向启动子驱动此蛋白的转录表达，并对FOXL2的转录具有增强作用。就三者关系而言，Boulanger等[28]发现PISRT1基因可能与山羊的间性无关，而FOXL2与山羊的间性有关，PFOXic与FOXL2共用一个双向启动子且它们的表达呈线性关系。

在PIS的物理图谱研究中，发现PIS区距PISRT1大约30 kb，距FOXL2大约300 kb。据李东锋等[29]报道：PIS区域的结构中包含四个重复序列(LP、A2、RP和L1)，其中LP、A2和RP属于反向转座子(Retrotransposable Element, RTE)家族[30]。根据NCBI序列(AF404302)，以PIS区域的第一个碱基为起始点，第2-20 nt是CAGTT重复区，重复4次；21～548 nt为短散布元件(SINE)Art2；218～1 502 nt为逆转录酶(RT)结构域；2 770～2 856 nt为核酸内切酶(EN)结构域；3 041～3 140 nt为牛短散布元件tA2右单体的左半部分；RP中间完整的保留了RT结构域(5 587～6 871 nt)；A2位于碱基3 988～4 565 nt之间，保留了部分RT结构域(4 205～4 565 nt)[29](图1b)。基于DNA序列分析，侯策等[31]成功克隆PIS区域全长，鉴定了30多个多态位点，并判断可能与关中奶山羊的角型性状有关，找到了1个tRNA转录位点、2个微卫星、3个microRNA转录位点以及L1-EN、RT-nLTR-like样保守结构域，还发现1个CpG岛、1对反向重复序列和2段串联重复序列(图1b)。

4 间性山羊的检测方法

间性的出现受多种因素影响，目前其发生机理尚不清楚，但间性的出现会对山羊群体的饲养管理以及养羊产业的经济效益等方面产生危害：(1)一般情况下，间性山羊尿生殖道呈畸形，会造成排泄障碍，后躯肮脏，严重影响发育，故死亡率极高；(2)间性山羊的性腺或生殖器官发育不正常，造成其激素分泌失调，代谢紊乱，从而影响情绪和行为，引起暴躁易怒，互相打斗、冲撞栅栏或饲养人员，甚至会造成妊娠母羊流产等一系列问题，不利于饲养和管理；(3)间性羊生长速度较慢，饲料利用率低，肉质差，造成经济效益低下；(4)间性羊不具有生殖能力，无法繁殖后代。已经有研究报道间性是常染色体隐性遗传，故间性基因携带者若不通过一些方法措施排除，会使群体内间性基因的基因频率越来越高，群体繁殖力越来越低，经济效益也会越来越低，为此，需要对间性山羊进行有效检测，以便进行有效预防，提高养羊业经济效益。

目前，间性山羊的检测方法主要有3种：(1) 细胞生物学方法：利用染色体核型分析，观察胚胎细胞的性染色体形态，判断染色体是否发生嵌合或缺失，鉴定是XX染色体还是XY染色体，进而判断其性别以及是否为间性。该方法的缺点是分析性染色体时需要获得分裂中期的细胞，其操作难度较大，不方便，费时而且对于分子水平的突变、易位、缺失不能准确鉴别[3]。(2) 免疫学方法：在早期胚泡期，雄性胚胎表达一种雌性胚胎所没有的细胞表面因子H-Y抗原，Wachtel等[32]发现无角间性山羊为 H-Y+[32]，而已有研究表明无角间性山羊的遗传基础是雌性[4]，故可以将核型分析与抗原抗体免疫反应相结合来排除无角间性山羊。Shalev等[33]利用A蛋白玫瑰花环技术，发现相同基因型和性别的动物在它们细胞表面H-Y抗原的密度不同，据此，即可判断间性山羊是偏雄性还是偏雌性。故利用H-Y抗原和抗体免疫反应的原理可对胚胎进行间性鉴定。(3) 分子生物学方法：①Y特异性探针检测法。即分离Y染色体上具雄性特异性DNA序列，TDF(TestisDeterminingFactor)基因与SRY(Sex-determiningRegionY)序列，用同位素标记成探针，与目的DNA杂交，若结果为阳性，则该个体为雄性，否则为雌性。这种方法的准确率超过95%。但这些特定序列通常具有种间特异性，故对每种动物都必须研制不同的探针[34]。②PCR法。即可根据间性个体与正常个体DNA水平上的差异，通过检测不同的特征基因来确定家畜是否为间性。一种是通过合成SRY、ZFY或其他Y-染色体上特异性片段的部分序列作为引物，在一定条件下进行PCR扩增，能扩增出目标片段的个体即为雄性，否则为雌性；另一种是在PIS区域的11.7kb片段内外设计多对引物，根据扩增出的条带的长度判断的山羊基因型(图1c)，进而通过选种选配等操作可在1～2代内迅速降低PIS区缺失的基因频率。例如：2012年杨波等设计了3对引物，141 bp的PIS-，449 bp的PIS+和300 bp的NEI，利用PCR的方法检测了224个个体的奶山羊群体，发现该群体PIS-PIS+杂合个体的频率高达66.9%，PIS+基因频率为35.3%，子代出现间性山羊的可能性超过12%[35]。该法其特异性强、灵敏度高、快速、简便且经济，有很大的发展空间和应用前景。③AFLP法。是一种选择性扩增限制性片段的方法，具有RFLP技术的重复性好、可靠性高和PCR技术的高效性、方便性和安全性等优点[36]，已广泛应用于动植物以及微生物遗传多样性的研究。

然而，在实际生产中，间性个体由于不具有繁殖能力等危害，必然被养殖户淘汰。同时养殖户更倾向于选育便于饲养管理且攻击性小的无角羊，故为减少间性个体的产生，目前主要借助分子生物学方法。对山羊群体进行PIS缺失的杂合子和纯合子鉴定，并结合形态学鉴定分类和遗传学分析，调整山羊的选种和选配方式，从而降低PIS缺失的基因频率，减少间性山羊出生的概率。目前分子生物学技术已非常成熟，通过与动物育种工作相互结合，这样，不仅能突破传统育种方式的禁锢，又能快速达到目的，减少间性山羊的出现，从而提高经济效益。

5 结 语

从意识到间性山羊对畜牧业的巨大危害开始，科研人员就从未停止过对山羊间性现象与机理的探索，目前已可以确定无角性状与间性性状是连锁的，发现了PIS区域。但是，目前还不能确定PIS区域的完全缺失是否由无角间性性状的突变所致，并且PIS区域的具体作用机制也不明确。此外，间性山羊的核型的变异与PIS区域的缺失与否有没有直接联系，PIS区域内的各种元件究竟发挥着怎样的作用，也还是未知。随着分子遗传学、生物信息学与实验技术的发展，对山羊PIS的研究也将逐步深入，相信在不久的将来，山羊PIS的作用机制将被完全揭开，我们也会发现更高效、更精确的检测方法，减少群体内PIS个体的产生，促进我国畜牧业的蓬勃发展。