圆齿野鸦椿朔果着色及呈色分析

袁雪艳，邹小兴，黄 维，张晓华，陈泽明，孙维红，李艳蕾，陈路瑶，邹双全

（福建农林大学林学院自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

圆齿野鸦椿Euscaphis konishii Hayata为省沽油科Staphyleaceae野鸦椿属Euscaphis植物，是赏药两用的优良乡土树种。传统及现代医学研究表明，圆齿野鸦椿果实有很好的抗癌及抗炎症等作用，其根、花、干果均可入药[1]。而且近年来，圆齿野鸦椿开始用作观赏植物[2-3]， 最突出的观赏部位是果实，其挂果期长达6个月，满树的红果横跨秋冬季节，可为秋冬季节增添许多喜庆的色彩，被认为是极具开发潜力的秋冬季观果树种。目前，有关圆齿野鸦椿的相关研究仅集中在繁殖技术[4]、化学成分研究[5]和药理研究[6]等方面，而有关果实着色机制的研究未见报道。

在果实发育过程中，果实的呈色与叶绿素（Chlorophyll）、类胡萝卜素（Carotenoid）和类黄酮（Flavonoid）的种类和含量比例有关[7]。通常，果实在幼果时为绿色，成熟后则呈现多彩的颜色，这是因为随着果实的成熟，果实细胞中的叶绿素不断降解，黄色、橙色果实中的类胡萝卜素和紫色、红色果实中的花青素（Anthocyanin）（属于类黄酮物质）的不断积累的结果[8]。果色是影响经济果品经济价值的重要因素之一，在各类果树中已引起广泛关注，如猕猴桃[9]、柑橘[10]和荔枝[11]等，同时果色作为园林观果树种最重要的观赏性状之一，果实变色机理已在秋海棠[12]、南天竹[13]等观果植物进行过研究，但圆齿野鸦椿作为极具观赏价值的观果树种，其朔果发育过程中果实生长发育和色泽变化方面的变化机理未见报道。现今，广泛应用的园林观赏植物均具多元化的观赏性，单一的叶色、花色、果色等已不能满足人们的观赏需求，于是利用分子手段人工调控观赏性状逐渐成为园林观赏植物的研究趋势。因此，本文研究圆齿野鸦椿朔果7个时期的色素和色泽变化，以探讨其果实色素与呈色的变化规律，为深入研究圆齿野鸦椿果实颜色调控机制、选育圆齿野鸦椿新品种提供理论依据及技术支持，也为利用分子生物手段改良品种提供生理学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在福建清流灵地镇选择3株生长基本一致且集中生长的圆齿野鸦椿作为试验样株，圆齿野鸦椿果实采样于6月末—11月初进行，共采集7个阶段（盛花期后50、70、100、115、130、160、180 d）圆齿野鸦椿果实,见图1。将一部分圆齿野鸦椿的果皮和种子进行分离，一部分用锡纸包住，冻存于干冰中，运回实验室后马上用液氮速冻存放于-80 ℃冰箱备用。一部分用60 ℃鼓风干燥箱烘干至恒质量，并称取干质量，另外再摘取新鲜的果实存于装有冰袋的冰盒中，运回实验室后马上用相机拍摄整体果实外观、内果皮和外果皮。

1.2 试验方法

1.2.1 果实颜色数字化描述

在晴天光线充足的环境下用同一相机拍摄。相机机身为Nikon/尼康 D 810，镜头Nikon 7 mm F 2.8微距镜头。相机设置：光圈优先，镜头光圈F8，白平衡设置为日光模式。背景纸选用白色A4纸。颜色数字化描述参照李欣等[14]的方法。打开Photoshop 图像处理软件，选取CMYK 模式命令，添加试材图像到选区，选取果实两侧的中间部位，从顶端到果梗的前端进行切割，切割的果长乘以黄金分割点0.618（从顶端开始算起），得到待测区域，再用吸管吸取外果皮、内果皮和种皮典型色域的颜色，得出C（青色）、M（洋红色）、Y（黄色）、K（黑色） 的百分比值。

1.2.2 果实色素的初步分析

1.2.2.1 色素类型的定性分析

取不同发育时期的果实，经液氮研磨后各取0.1 g于10 mL离心管中，分别加入石油醚、10%盐酸溶液、30%氨水5 mL，观察颜色变化并进行记录。

1.2.2.2 类黄酮的显色反应

测定方法参照智雅静等[15]的方法，取不同烘干果皮粉末各0.1±0.005 g，分别用盐酸（HCl）化甲醇（MeOH）溶液（HCl与MeOH体积比为1∶99） 提取15 h，过滤，定容至25 mL，各取2 mL提取液，进行以下9种显色反应：浓盐酸-锌粉反应；浓盐酸-镁粉反应；三氯化铁反应；三氯化铝反应；氨性氯化锶反应；硼酸反应；浓硫酸反应；碱性试剂反应；硼氢化钠反应。

1.2.3 果皮色素的定量分析

参照高俊凤的方法[16]测定叶绿素和类胡萝卜素的含量；采用热浸提法测定圆齿野鸦椿果实的类黄酮含量，具体方法参照吴清韩等[17]的方法；采用超声辅助的pH示差法测定圆齿野鸦椿果实的花青素，具体方法参照杨敏等[18]和吴春太等[19]的方法。

2 结果分析

2.1 果色的数据化描述

随着果实的成熟，外果皮的C、M、Y、K值变化差异显著，见图1、图2。由图1、图2可知，K值始终保持低值，在盛花期后50～70 d的C、M、Y值大小依次为：Y＞C＞M，在70 d之后则呈现Y≥M＞C，说明在外果皮绿色期C、Y值对色彩的变化起决定作用，而外果皮从红绿相间到全红，是M、Y值起决定作用。

在果实发育过程中，内果皮的C、M、Y、K值的变化呈现出一定的规律，在7个发育阶段中K值均接近0，而Y值基本处于高值。随着果实的成熟，C值呈逐渐下降的趋势，在盛花期后70 d就低于M值，而M值则逐渐升高，并在盛花期100 d超过Y值，之后均保持高值。即，在盛花期后50 d时，C、Y是内果皮呈现嫩绿色的主要原因，在盛花期后70～180 d内果皮由粉绿相间逐渐变成全红，是由M、Y值起决定作用，见图1、图2。

圆齿野鸦椿种皮颜色的变化是观测果实成熟的重要指标。在盛花期50 d，其种皮为乳白色，C、M、K、Y均为最小值；盛花期后70 d，种皮为棕色，其K值接近0，C值略大于50 d，而M、Y值则呈现激增的现象，说明种皮棕色与M、Y值关系密切；盛花期后100～115 d，属于棕黑相间的时期，期间C、K值逐渐升高，Y值逐渐下降，而M值则先降后升；盛花期115～180 d，属于C、K值先急剧增大后趋于平稳，且C、M、Y、K值相互间逐渐接近，说明C、K值对种皮颜色加黑有决定性作用，见图1、图2。

图1 圆齿野鸦椿果实颜色变化Fig. 1 The color change of Euscaphis konishii Hayata fruit

图2 外果皮(ex)、内果皮(en)和种皮(sc)颜色测定结果Fig. 2 The results of exocarp, endocarp and seed coat color

2.2 果实色素类型的特征颜色反应

在石油醚反应中，若提取液出现黄色，说明果皮中可能含有类胡萝卜素。本试验中，7个发育时期的圆齿野鸦椿果皮的石油醚显色反应都出现无色，说明类胡萝卜素含量极低或者不含类胡萝卜素。

在10%的盐酸测试中，若提取液呈现红色，则说明果皮中可能含有花青素。本试验中，提取液出现无色、粉色、红色3类颜色。其中，盛花期后50～70 d为无色，说明不含花青素或花青素含量极低；盛花期后100～115 d出现淡粉色和粉色，说明花青素含量较低；盛花期后130～180 d表现为淡红色和红色，说明花青素含量较高。

在30%氨水测试中，7个不同发育期的圆齿野鸦椿提取液表现出不同程度的黄色。盛花期50、130 d出现深黄色，表明果皮中可能含有黄酮醇类化合物；盛花期后70、100、115、160 d呈现黄色，表明果皮中可能含有黄酮色素。见表1。

表1 圆齿野鸦椿果皮色素类型测试的颜色反应†Table 1 Color reaction of pigments of Euscaphis konishii Hayata

2.3 类黄酮的定性测试

（1）浓盐酸-锌粉反应：由表2可知，盛花期后50～100 d出现不同程度的黄色，表明这3个时期的圆齿野鸦椿果皮可能含有黄酮，而盛花期后115～180 d呈现不同程度的粉色和红色，表明可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮或花青素类化合物，说明果实发育过程中会产生新的黄酮类化合物。

（2）浓盐酸-镁粉反应：盛花期后50～70 d出现绿色和黄色，而100～180 d出现不同程度的粉色和红色，说明在100 d之后可能合成了黄酮、黄酮醇、二氢黄酮或花青素类化合物。

（3）FeCl3反应：由表2可知，不同发育时期的圆齿野鸦椿果实浸提液与FeCl3反应均出现深褐色，说明7个发育时期的果皮均不含酚羟基。

（4）AlCl3反应：盛花期后50、70 d出现不同程度的黄色，说明可能含有黄酮。

（5）氨性氯化锶反应：不同发育时期的果皮均出现沉淀，说明含有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物。

（6）硼酸反应：不同发育期的果皮不同程度的绿色、粉色及红色，说明不含C5-OH结构。

（7）浓硫酸反应：不同发育时期的果皮浸提液均出现红褐色，可能含有花青素。

（8）碱性试剂：盛花期后50、130 d出现颜色较深的黄褐色，相比之下，其余的5个发育时期则出现颜色较浅的黄色，说明前者可能含有的二氢黄酮或二氢黄酮醇大于后者。

（9）硼氢化钠反应：盛花期后50～70 d出现绿色和黄色。100～180 d出现不同程度的粉色和红色，说明100 d之后可能产生了二氢黄酮。

表2 圆齿野鸦椿果皮类黄酮的显色反应Table 2 Color reaction of flavonoids in different Euscaphis konishii Hayata

2.4 果皮色素成分的紫外可见光谱分析

利用可见紫外分光光度计在400～700 nm范围内全波段扫描叶绿素和类胡萝卜素提取液，叶绿素的特征吸收峰出现在665 nm附近，类胡萝卜素大约在435、470 nm有吸收峰；类黄酮在500 nm左右出现峰值，且无杂峰干扰，在500 nm处，测定标准样品的吸光值，并以吸光值为纵坐标，质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制芦丁标准曲线。得到回归方程为：y＝4.917 2x＋0.005 1，R2＝0.999 1，表明芦丁质量浓度在0.013 8～0.082 8 mg/mL范围内线性关系良好；花青素在520 nm左右出现峰值，且无杂峰干扰。

图3 叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮和花青素光谱扫描图Fig. 3 UV-Vis absorption spectrum of chlorophyl, carotenoid, flavonoid and anthocyanin

2.5 果皮色素含量分析

在圆齿野鸦椿果实发育过程中，叶绿素呈现先急剧下降到缓慢下降的趋势。盛花期后50 d叶绿素含量最高，其含量高达0.303 mg·g-1，在盛花期30～115 d叶绿素含量急剧下降，之后下降趋势减缓，并在180 d达到最小，见图4A。

由图4B可知，在不同的发育阶段，圆齿野鸦椿类胡萝卜素含量分布在0.016～0.050 mg·g-1之间，含量均较低，随着果实的成熟，类胡萝卜素基本呈现不断下降的趋势。类胡萝卜素与叶绿素之间呈显著正相关（R＝0.991）（表3），说明在合成代谢过程中二者可能有良好的协同作用。

在果实发育过程中，类黄酮含量出现先下降后上升再下降的S型变化趋势，见图4C。由图4C可知，类黄酮最高出现在盛花期后50 d，含量高达28.378 mg·g-1，之后出现剧降，直到盛花期后100 d才又开始逐渐上升，并在盛花期后130 d出现第二个峰值25.326 mg·g-1，之后开始逐渐下降至盛花期180 d出现最低值20.975 mg·g-1。类黄酮与叶绿素和类胡萝卜素均呈显著正相关，而与花青素相关性不显著，见表3。

图4 果实主要色素的变化Fig. 4 The changes of fruit pigments

图4D表明，随着野鸦椿果实的不断成熟，花青素的积累量不断增加。其中，在盛花期后50～70 d，花青素含量缓慢增加，在盛花期后70～180 d，花青素含量处于激增状态，并在180 d达到最高值3.880 mg·g-1。花青素与叶绿素和类胡萝卜素均呈显著负相关（表3），说明果实呈色过程中，叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐减少，伴随着花青素的增加。

2.6 果实色泽与色素含量的关系

在CMYK模式中，C、M值分别代表青色和洋红，测得圆齿野鸦椿果皮的叶绿素和类胡萝卜素含量与内外果皮的C值呈显著正相关，而与M值呈显著负相关，说明圆齿野鸦椿从绿色变为红色，可能与叶绿素和类胡萝卜素的降解有关；类黄酮的含量很高，但却与内外果皮的CMYK值均无显著相关，说明圆齿野鸦椿果实发育过程中，类黄酮出现了较为复杂的变化，可能会有新黄酮类物质产生同时伴随某些黄酮类物质消解；花青素的含量与内外果皮的C值呈显著负相关，而与外果皮的M值、内果皮的M、Y值呈显著正相关，说明果实由绿转红的过程中，可能与花青素的积累有关。

表3 果实色素间及色素与CMYK值间的关系†Table 3 The relationship between fruit pigments and CMYK value

3 讨论与结论

为了减少外界环境和主观因素的影响，近年来，数码技术已经开始运用在植物色彩的描述上，如利用数码技术描述观赏海棠的色彩[14]、测定板栗果实的褐变[20]、描述芒果花瓣和花药的色彩[21]等。因此本试验利用数码测色法观测圆齿野鸦椿果实色泽的变化，结合实际内外果皮的颜色的变化（绿色→红＋绿→红色），发现果皮的绿色与C、Y值关系密切，而果皮的红色是由M、Y值起决定作用的。CMKY值与色素含量相关性分析也表明，果实发育过程中逐渐下降的叶绿素和类胡萝卜素含量，与果皮的C值均呈显著正相关，与M值呈显著负相关，而果实发育过程中逐渐升高的花青素的含量与果皮的C值呈显著负相关，而与果皮的M值显著正相关，说明果实由绿转红的过程中，可能与叶绿素和类胡萝卜素的降解，并伴随着花青素的积累有关。

相关的研究表明，果实中含有叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮（花青素为类黄酮物质）等多种色素，在果实发育的过程中，因各部分色素不断代谢使果实的颜色发生变化。本研究表明，圆齿野鸦椿果实逐渐成熟的过程中，果皮呈现绿色→红＋绿→红色的色彩变化。随着圆齿野鸦椿果实的成熟，各色素的变化呈现一定的规律，其中叶绿素和类胡萝卜素的含量均呈逐渐下降的趋势，且两者呈显著正相关，可能在合成代谢过程中二者有良好的协同作用，类胡萝卜素对叶绿素分子有保护作用，具体作用机理有待进一步研究；花青素则出现逐渐上升的趋势，与其它色素含量呈负相关，其中与类胡萝卜素、叶绿素负相关显著，结果与李果[22]、山楂[23]等的研究结果一致，说明果实呈色过程中，叶绿素和类胡萝卜的含量逐渐减少，伴随着花青素的增加，花青素的积累与果实逐渐变红可能有密切的联系；类黄酮含量出现先下降后上升再下降的S型变化趋势，分别在盛花期后50和130 d出现峰值，说明果实发育过程中可能会产生新的黄酮类化合物，并伴随着某些类黄酮物质的消解，这在黄酮类物质显色反应中得到相互印证，类黄酮的变化与花青素的变化没有显著相关性，这与苹果[24]色素的研究结果一致，可能是随着果实的成熟，果实中花青素含量不断升高，光合产物流向花青素的合成途径，减缓了酚类物质的合成，从而使果实中类黄酮含量较稳定。

综上所述，本试验利用传统的方法对圆齿野鸦椿果皮色素的组成及含量进行了初步定性、定量分析，但要对色素进行精确的定性及定量分析还需要利用更精准的现代技术，如利用HPLC和LC-MS等，而且本试验的试验材料采自清流，还需采集多个地方的圆齿野鸦椿果实观测其呈色变化，以便对圆齿野鸦椿果实颜色着色机制有更全面和精确的了解。