紫草素对高糖诱导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激的影响

王喜欢， 张金华， 胡亚南， 张 洪

(南阳市第二人民医院心血管内科， 河南 南阳 473000)

血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)是被覆于血管内膜的一群细胞，代谢活跃且可合成及分泌大量的血管活性物质，对维持血管正常生理功能具有重要作用[1]。研究显示，在糖尿病血管并发症中均涉及到血管内皮的损伤及功能障碍，且这种损伤可进一步诱发和加重其它急性心血管疾病的风险[1-3]。众多研究发现，急、慢性的高糖状态可抑制血管内皮细胞生长，并诱发内皮细胞的凋亡，继发血管内皮损伤[4]。但是，关于高糖诱发内皮细胞凋亡的确切机制还不甚明了，多数研究认为，活性氧生成增加所致的氧化损伤和氧化应激反应是关键的因素之一[5]。故而维持内皮细胞中氧化还原反应平衡对于保护血管内皮具有重要的意义。紫草素(shikonin)是从紫草的根中提取的一种脂溶性萘醌类化合物，其药理学作用研究表明，紫草素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗肿瘤等作用，具有广阔的临床应用前景[6-8]。本研究以大鼠胸主动脉内皮细胞为研究对象，评估紫草素对高糖诱导内皮细胞凋亡的影响，并从氧化应激的角度初步探讨其可能的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

细胞培养用DMEM培养基购自HyClone；紫草素购自Enzo Biochem，其化学结构如图1A所示；大鼠胸主动脉内皮细胞为本实验室自行冻存；抗cleaved caspase-3/caspase-3和β-actin抗体购自Cell Signaling Technololgy；抗Nrf2 (nuclear)、 Nrf2 (total)、 H3及HO-1抗体购自Santa Cruz； CCK-8细胞活力分析试剂盒购自广州奕源公司；细胞核蛋白分离试剂盒、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所； 丙二醛(malondialdehyole, MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；流式细胞术凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司。

2 实验方法

2.1细胞培养、分组和干预 VECs用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素、1%链霉素及10 μg/L β-ECGF的DMEM液体培养基培养于37 ℃、5% CO2细胞培养箱，定期换液及传代，保证细胞良好的生存状态。将消化后的细胞接种至细胞培养皿中，待细胞贴壁生长至约80%融合时，更换培养基对细胞做12 h的饥饿处理，而后加药干预。细胞组别设置为：正常对照组(control组，培养基中葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、高糖组(Gh组，培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高糖+低浓度紫草素组(GSl组，培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L，紫草素浓度为0.1 μmol/L)、高糖+中浓度紫草素组(GSm组，培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L，紫草素浓度为1 μmol/L)和高糖+高浓度紫草素组(GSh组，培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L，紫草素浓度为10 μmol/L)。

2.2CCK-8法测定细胞活力 将消化后的细胞按照每孔5×103个的密度接种至96孔板，经相应的药物干预后，在超净台中向每孔加入CCK-8试剂10 μL，重新放回CO2培养箱中继续培养2 h。取出培养板用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度(A)值，计算细胞的相对活力。每组设置3个复孔取其均值，同时设只加入培养基的单孔作为空白对照。

2.3检测MDA和ROS的含量及SOD和GSH-Px活性的变化以评价细胞氧化应激状态 各项检测均依据公司提供的试剂盒说明书进行操作。

2.4细胞凋亡检测 本实验采用流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测细胞经干预后的凋亡状况。各组细胞消化后，用PBS漂洗2次，然后离心收集细胞，依据说明书要求加入Binding Buffer，而后室温条件下加入Annexin V-FITC避光孵育10 min，最后避光条件下加入PI孵育5 min。流式细胞仪检测各组的荧光强度并进行定量分析；检测条件为 Ex=488 nm， Em=530 nm。

2.5Western blot 检测蛋白水平 对于细胞核蛋白核Nrf2的测定，首先根据细胞核蛋白分离试剂盒说明书提取核蛋白；总蛋白的检测直接进行RIPA裂解液收集细胞蛋白。对所提蛋白(包含分离的核蛋白和全蛋白)进行定量，然后依据定量结果调整蛋白上样量(60 μg)后进行SDS-PAGE。待电泳结束，通过电转的方法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。取出PVDF膜置于小盒子中，并在室温条件下加入5%的脱脂牛奶封闭90 min，弃牛奶后按说明书要求的比例加入相应的 I 抗4 ℃孵育过夜，次日取出PVDF膜经TBST洗涤3次，每次5 min；然后按说明书要求加入相对应的 II 抗室温孵育2 h，经TBST洗涤3次后于暗室中撒ECL发光液显影，曝光并冲洗胶片。全蛋白以β-actin为内参照，核蛋白以H3为内参照。所得结果采用ImageJ进行灰度半定量分析。

3 统计学处理

所得数据录入SPSS 15.0软件中进行统计学分析。实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较用Bonferroni校正的t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 紫草素对高糖诱导的内皮细胞凋亡的作用

CCK-8法细胞活力检测的结果显示，高浓度的葡萄糖可致使内皮细胞活力降低，而同时给予不同浓度的紫草素(结构式见图1A)干预后，细胞活力有所回升，且紫草素浓度在1 μmol/L及10 μmol/L时的作用显著，见图1B。流式细胞术Annexin V/PI双染法细胞凋亡检测的结果显示，高浓度葡萄糖处理内皮细胞后，细胞的早期凋亡率显著上升(P<0.05)；而加入1 μmol/L及10 μmol/L的紫草素干预后，细胞早期凋亡率分别降低(P<0.05)，见图2A。Western blot检测结果显示，高浓度葡萄糖处理内皮细胞后，caspase-3发生剪切，而加入1 μmol/L和10 μmol/L的紫草素干预后，cleaved caspase-3明显减少(P<0.05)，见图2B。以上结果提示紫草素可抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡。

2 紫草素对高糖诱导内皮细胞氧化应激的影响

如图3所示，Gh组的内皮细胞经高糖诱导后， MDA及ROS的含量显著增加，同时胞内SOD及GSH-Px的活性显著降低(P<0.05)；而GSm组和GSh组的细胞分别经1 μmol/L及10 μmol/L紫草素干预之后，MDA及ROS的含量相比于Gh组显著降低， SOD及GSH-Px的活性相比于Gh组则显著增加(P<0.05)。这些结果说明高糖可诱导内皮细胞中氧化应激反应的发生，而紫草素可部分抑制该作用。

3 紫草素对高糖诱导内皮细胞中Nrf2/HO-1信号通路活性的影响

Western blot检测结果如图4所示，Gh组的内皮细胞经高糖诱导后，HO-1及核内Nrf2的蛋白水平增加，总Nrf2的蛋白表达未出现明显变化；而GSh组的细胞经10 μmol/L紫草素干预之后，HO-1和核内Nrf2的蛋白水平相比于Gh组显著降低，总Nrf2蛋白的水平没明显变化。这一结果说明紫草素可抑制内皮细胞中抗氧化信号通路Nrf2/HO-1的激活，进而促进凋亡效应蛋白caspase-3的活化，维持胞内氧化应激状态的稳定。

Figure 1. The effect of shikonin on the viability of VECs induced by high glucose. A: the structural formula of shikonin; B: the cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

图1紫草素对高糖诱导内皮细胞活力的影响

讨 论

紫草素是一种中草药提取物，具有抗氧化应激和抗炎等广泛的药理活性。本研究以高糖刺激大鼠来源胸主动脉内皮细胞诱导内皮细胞损伤模型，而后在此基础上研究紫草素对内皮损伤的作用。结果显示高糖刺激可显著降低内皮细胞活力，并诱导细胞凋亡；而经紫草素干预后细胞凋亡率有所降低。结果提示紫草素可抑制高糖所诱导的内皮细胞凋亡，具有一定保护血管内皮的活性。

然后我们进一步研究了紫草素抑制高糖所致的内皮细胞凋亡中可能涉及的作用机制。正常生理状态下，细胞内存在多种抗氧化物质，可及时清除细胞代谢过程中生成的各种活性氧，维持氧化还原反应的平衡[9]。一旦胞内氧化产物如MDA及ROS聚集过多，超出了抗氧化系统(如SOD及GSH-Px)的调节范围，即会导致胞内氧化应激的产生，并进一步通过复杂的信号通路致使细胞凋亡[10-11]。早期的研究提示，高浓度的葡萄糖可刺激细胞内活性氧的生成[12]。故而本研究检测了内皮细胞中的氧化应激状态，结果显示经高糖诱导后，内皮细胞中MDA及ROS的含量显著增加，同时胞内SOD及GSH-Px的活性显著降低；加入紫草素干预则可下调胞内MDA及ROS的含量，同时升高 SOD及GSH-Px的活性。结果表明高糖可诱导内皮细胞中ROS的聚集及氧化应激反应的发生，而紫草素可部分抑制该作用；这可能是紫草素在高糖环境下保护血管内皮的机制之一。

Figure 2. The effect of shikonin on the apoptosis of VECs induced by high glucose. A: the representative images of Annexin V/PI double staining by flow cytometry and statistical analysis of cell apoptosis; B: the representative images of Western blot and statistical analysis of cleaved caspase-3 protein levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

图2紫草素对高糖诱导内皮细胞凋亡及凋亡蛋白的影响

细胞内还存在应对氧化应激反应的防御机制， Nrf2就是其中之一。在氧化应激发生时，Nrf2活化后进入细胞核结合抗氧化原件，促进各种抗氧化酶及解毒酶的合成，去除过量的ROS，以抵抗氧化应激损伤[13-15]。HO-1即是Nrf2下游的一种血红素降解限速酶，具有较强的自由基清除作用，可对抗氧化损伤[15-17]。故而本研究进一步检测了在高糖诱导的内皮细胞损伤中，Nrf2信号通路的状态以及紫草素的作用。结果显示，经高糖诱导后内皮细胞中HO-1及核内Nrf2的蛋白表达增加，总Nrf2的蛋白表达未出现明显变化；可能是高糖刺激活性氧的生成激活了细胞内的自我保护机制，通过促进胞内Nrf2的核转位以及下游HO-1的表达来降低氧化应激所致的损伤。而内皮细胞经10 μmol/L紫草素干预后，HO-1和核内Nrf2蛋白表达水平显著降低。这提示紫草素可降低核内Nrf2的表达，其减轻高糖所致的氧化损伤的作用可能与Nrf2/HO-1信号通路密切相关。

Figure 3. The effect of shikonin on the status of oxidative stress in VECs induced by high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

图3Shikonin对高糖诱导内皮细胞氧化应激的影响

Figure 4. The effect of shikonin on the activation of Nrf2/HO-1 pathway in VECs induced by high glucose. A: the representative images of Western blot and statistical analysis of nuclear (N) and total (T) Nrf2 expression; B: the representative images of Western blot and statistical analysis of HO-1 expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

图4Shikonin对高糖诱导内皮细胞Nrf2/HO-1信号通路活性的影响

综上所述，紫草素可显著抑制高糖诱导的血管内皮细胞凋亡，并通过下调核Nrf2转位和 HO-1的表达，以抵抗高糖诱导的内皮细胞氧化应激损伤，对细胞产生保护作用。