NCoR和SRC⁃1在子宫内膜重度不典型增生中的表达及意义

李翠芬 刘燕燕 杨宇峰 霍炽文

东莞市第三人民医院妇科（广东东莞523326）

子宫内膜癌是女性常见生殖道恶性肿瘤，约占女性生殖系统恶性肿瘤的25%［1］，其发病历经子宫内膜增生不伴不典型增生及子宫内膜不典型增生及癌变过程，其中子宫内膜不典型增生则为子宫内膜癌癌前病变常见类型，报道显示其进展为子宫内膜癌风险高达23%［2］。至今子宫内膜癌仍缺乏敏感性及特异性较高的血清肿瘤标志物，探索研究更多的标志物对于子宫内膜癌及癌前病变的诊治有很高的临床价值［3］。现国内外常用治疗子宫内膜不典型增生及局部癌变的药物为孕激素和促性腺激素释放激素激动剂，研究发现病变内膜对药物的反应率达57%～94%。孕激素类的作用机制为减少子宫内膜的雌激素核受体水平；抑制子宫内膜DNA合成；增加雌二醇向雌酮等活性较弱的雌激素转化。目前认为子宫内膜癌属激素依赖性肿瘤，雌激素及抗雌激素水平的变化与子宫内膜癌发病存在密切关联，且子宫内膜不典型增生同样与子宫内膜长期持续受雌激素刺激有关［4］。施秀等［5］发现雌激素受体（ER）状态与子宫内膜病变程度有关，同时可反映子宫内膜细胞组织对治疗的敏感性，是信号传导通路是子宫内膜癌防治的关键靶点。而核受体共调节蛋白因子则为与该通路密切相关的重要元件，其包括共/辅助激活因子（N⁃CoA）与共/辅助抑制因子（N⁃CoR），目前认为核受体共刺激因子（SRCs）异常表达可增强ER调控靶基因转录活性，促进子宫内膜癌变。类固醇受体辅活化子⁃1（SRC⁃1）则属于p160家族成员，具备氨酸乙酰化转移酶活性，可调节转录因子与靶基因结合，强化雌激素所诱导细胞增殖能力［6］。但目前国内外尚无报道围绕子宫内膜不典型增生患者N⁃CoR、SRC⁃1表达水平的变化展开。基于此，为探讨N⁃CoR、SRC⁃1在子宫内膜重度不典型增生患者中的表达及其意义，现对收治的60例子宫内膜重度不典型增生患者及30子宫内膜正常对象进行了研究分析，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月至2017年2月我院收治的60例子宫内膜重度不典型增生患者作为观察组。纳入标准：均经病理检查证实为子宫内膜重度不典型增生；强烈要求保留子宫，自愿要求进行药物治疗；均为本市常住居民，可完成随访调查；知情且已签署研究同意书。排除标准：合并严重心肝肾肺疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并急慢性感染者；合并严重精神障碍者；合并高血压或糖尿病者；不能配合随访者。选择同期来我院行内膜活检的30例既往无子宫内膜病变的正常健康人作为对照组。对照组既往均无子宫内膜增厚及病变表现，月经规律，来我院行全身体检，同意行子宫内膜活检，于月经干净3天来院行宫腔镜检查及子宫内膜活检。观察组年龄31～50岁，平均（43.6±3.1）岁；孕次0～6次，平均（2.6±1.2）次；产次0～4次，平均（1.6± 0.9）次。对照组年龄32～49岁，平均（42.9± 3.5）岁；孕次0～7次，平均（2.4±1.1）次；产次 0～3次，平均（1.7±0.6）次。

1.2 主要试剂与仪器 兔抗人NCoR多克隆抗体（购自Abcam公司）；兔抗人SRC⁃1多克隆抗体［购自Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司］；兔抗人孕激素受体（PR）多克隆抗体、ER多克隆抗体（均购自Abcam公司）；生物素标记羊兔二抗、SP免疫组化试剂盒［购自Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司］；逆转录⁃聚合酶链反应（RT⁃PCR）试剂盒、β⁃actin抗体、Trizol试剂盒（均购自Abcam公司）；NCoR、SRC⁃1引物（生工生物工程有限公司）。BX⁃50全自动显像照相系统、显微镜（日本Olympus公司）；电热恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）；格兰仕微波炉（广东格兰仕厂）；AS325转轮式切片机（英国Shandon公司），TN⁃100B型托盘式扭力天平（上海第二天平仪器厂）；PCR仪（美国伯乐公司）。

1.3 实验方法 （1）免疫组化SP法。两组均行子宫内膜活检，留取子宫内膜组织，石蜡包埋，切片机连续切片，厚度4～6 μm，切片水浴，晾晒，烘干备用，常规脱蜡，水化，浸于二甲苯，5 min×3次，切片置入无水乙醇，3 min×2次，梯度酒精脱水（90%、80%、70%），3 min×3次，置于蒸馏水内，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，5 min×3次，TMA上滴加3%H2O2，室温静置10 min，PBS冲洗，5 min × 3次，抗原修复，PBS冲洗5 min×3次，滴入山羊血清封闭液，静置20 min，去除多余液体，滴入一抗50 μL，室温静置60 min，滴加二抗50 μL，室温静置60 min，PBS冲洗3次，每次5 min，拭干切片周围液体，滴入显色剂DAB，室温静置5～10 min，显微镜下观察，显色完毕蒸馏水冲洗，终止显色，苏木精复染2 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化2 s，自来水冲洗，脱水，透明，中性树胶封片。每切片均随机取5个高倍视野，镜下观察细胞阳性情况，SRC⁃1、NCoR、ER、PR细胞阳性判定标准：采用改良法［7］，观察各切片染色细胞比例及强度，染色细胞比例分5级，分别为0分（染色细胞＜5%）、1分（染色细胞占5%～25%）、2分（染色细胞占25%～30%）、3分（染色细胞占50%～75%）、4分（染色细胞超过75%）；染色强度分为4级，分别为0（不着色）、1（浅黄色）、2（棕黄色）、3分（深棕色），染色细胞计数计分×染色强度计分为最终结果，阳性：≥1分（弱阳性：2～3分；中度阳性：4～5分；强阳性：＞5分）；阴性：＜ 1分。（2）RT⁃PCR法。留取子宫内膜组织60 mg置入RNase Free dish内，加入预冷Trizol，快速剪碎组织，成分研磨，加入Trizol，混匀，置入RNase Free EP管，静置，加氯仿，混匀，静置5 min后离心，吸上层水相液，加入异丙醇混匀，静置后离心，加入预冷75%乙醇，洗涤RNA，沉淀后离心，弃上清，加预冷无水乙醇，离心，弃上清，提取总RNA，-80℃低温冰箱保存，逆转录，EP管内加入总RNA 2 μL+Oligo（dt）180.5 μL+ 双蒸水 3.5 μL，65 ℃孵育5 min，水浴2 min，加入5 ×Buffer 2.0 μL+10 mmol/L dNTPmix 1.0 μL+RNasin 0.5 U/μL，混合均匀后离心，置于PCR仪器内42℃反应1 h，95℃孵育10 min，70℃反应15 min，设计引物，SRC⁃1上游引物：5′GTCATTCCTCCTTGAC⁃CAACTC 3′，下游：5′ATCCCTGTCCGCAGGTATC⁃TA 3′；NCOR 上游引物：5′ATACTTGCTGGATGGT⁃GGACT3′，下游：5′TCCTTGCTCTTTTATTTGACG3′；β⁃actin 上游：5′CCCATCTATGAGGTTACGC3′，下游：5′TTTAATGTCACGCACGATTTC 3′。PCR反应体系：5 × buffer 10 μL+ddH2O 28.75 μL+TakaRa TX Taq HS 0.25 μL+ 上下游引物各 0.5 μL+cD⁃NA 10μL，共50 μL，反应条件：94 ℃ 1 min，94 ℃30 s，57 ℃退火30 s，75 ℃ 1 min，25～35个循环，72℃延伸5 min，扩增结束加1.5%琼脂凝胶，紫外灯观察，凝胶系统照相，采用Gel⁃Pro Analyzer凝胶分析软件记录各条带光密度，将SRC⁃1、NCoR基因扩增产物与内参β⁃actin条带积分光密度值比值作为mRNA相对表达水平。

1.4 统计学方法 研究数据均采用SPSS 19.0软件进行处理，计量资料采用t检验或单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，各指标相关性分析采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜重度不典型增生镜下特点 子宫内膜重度不典型增生镜下见增生状态活跃，见细胞核不同程度异型性，细胞核形状一致，呈圆形或椭圆形，胞质嗜酸性红染或减少，见复杂腺体结构（图1A），间质减少，腺腔内连接，部分见筛孔状结构或共壁表现（图1B、C），见密集腺体增生（图1D），腺上皮指状突起，形成丰富腔内乳头结构（图1E、F）。

2.2 两组子宫内膜组织SRC⁃1、NCoR、ER、PR阳性率比较 观察组SRC⁃1阳性率（图2～3）高于对照组（P＜0.05），其NCoR（图4～5）、ER、PR表达阳性率低于对照组，对比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1～6 子宫内膜重度不典型增生腺体异常结构图，HE×200Fig.1～6 abnormal structural map of endometrium severe atypical hyperplasia，HE x 200

表1 两组子宫内膜组织SRC⁃1、NCoR、ER、PR阳性率比较Tab.1 Comparison of the positive rates of SRC⁃1，NCoR，ER and PR in the endometrium of the two groups 例（%）

2.3 两组子宫内膜组织SRC⁃1、NCoR mRNA表达水平比较 观察组子宫内膜组织SRC⁃1 mRNA水平明显高于对照组，其NCoR mRNA水平低于对照组，对比差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 子宫内膜重度不典型增生内膜组织SRC⁃1、NCoR表达与ER、PR相关性分析 子宫内膜重度不典型增生患者内膜组织SRC⁃1与ER表达呈负相关，而NCoR与PR表达水平呈正相关（P＜0.05），见表3。

图7 子宫内膜重度不典型增生SRC⁃1表达（SP×200）Fig.7 SRC⁃1 expression（SP × 200）of endometrial severe atypical hyperplasia

图8 正常子宫内膜src⁃1表达（sp×200）Fig.8 SRC⁃1 expression in normal endometrium（SP × 200）

图9 子宫内膜重度不典型增生NCoR⁃1表达（SP×200）Fig.9 NCoR⁃1 expression（SP × 200）of endometrial severe atypical hyperplasia

图10 正常子宫内膜NCoR⁃1表达（SP×200）Fig.10 NCoR⁃1 expression in normal endometrium（SP×200）

表2 两组子宫内膜组织SRC⁃1、NCoR mRNA表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression level of SRC⁃1 and NCoR mRNA in the endometrium tissue of two groups ±s

表2 两组子宫内膜组织SRC⁃1、NCoR mRNA表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression level of SRC⁃1 and NCoR mRNA in the endometrium tissue of two groups ±s

组别观察组对照组t值P值SRC⁃1 mRNA 33.45±16.52 7.25±3.54 8.565＜0.001 NCoR mRNA 6.54±4.26 34.84±5.45 27.010＜0.001

表3 子宫内膜重度不典型增生内膜组织SRC⁃1、NCoR表达与ER、PR相关性分析Tab.3 Correlation Analysis of SRC⁃1,NCoR expression and ER and PR in endometrial severe atypical endometrium

3 讨论

子宫内膜癌系女性生殖系统常见恶性肿瘤，子宫内膜重度不典型增生则为癌前病变的主要表现形式，目前认为子宫内膜不典型增生进展为子宫内膜癌主要与雌激素持续刺激子宫内膜壁有关［8］。BARISH 等［9］发现，无排卵、无孕激素对抗雌激素替代疗法、内分泌功能性肿瘤等均与子宫内膜不典型增生存在密切关联。子宫内膜癌作为激素依赖性肿瘤，其对雌激素有其较高的应答型，而雌激素及孕激素通过与子宫内膜ER、PR受体特异性结合后将信号传导其细胞特定部位，并影响相关基因调控及子宫内膜上皮细胞代谢。本研究发现，子宫内膜重度不典型增生患者其内膜组织ER、PR阳性率较正常子宫内膜组织低，提示子宫内膜重度不典型增生患者其内膜组织雌孕激素受体水平存在一定程度的改变，主要与子宫内膜组织ER、PR表达异常可能引起局部雌激素代谢紊乱，影响雌激素作用，导致子宫内膜不典型增生有关。但雌激素活性受到多个受体亚型调节，因此无法单纯通过ER水平的变化来判断子宫内膜不典型增生表现［10］。近年来发现，类固醇受体辅活化子家族可调节ER、PR活性，影响细胞增殖［11］。

SRC系类固醇受体辅活化子家族成员，其分子C端受体作用区同存在不同LXXLL系列，其以配体依赖形式与核受体相互作用，并通过甲基化、乙酰基化等辅助因子提高核受体基因转录活性，对ER、PR、糖皮质激素受体、甲状腺素受体等发挥转录调节效应，影响生长、发育其增殖［12］。其中SRC⁃1则为SRC家族中最早被克隆的基因类型，在正常组织中可见表达，同时在部分肿瘤患者中可见SRC⁃1异常表达。王丽红等［13］发现，乳腺癌患者机体SRC⁃1存在明显过度表达现象，对雌激素所诱导细胞增殖有明显的强化效应。SRC⁃1具有组氨酸乙酰化转移酶的活性，能够改变转录因子与靶基因的结合力，影响基因的转录。REINERI等［14］等报道称在乳腺癌细胞中ER/SRC⁃1复合物的存在增强了雌激素诱导的细胞增殖能力。所以类固醇受体辅助活化因子在调节ER功能上发挥了重要作用。NCoR为核受体辅阻遏子超家族成员，是非配体化核受体主要结合蛋白，与SRC相反，其具备去乙酰化转移酶活性，可与核受体结合蛋白作用发挥疏水裂隙作用，抑制其转录活性。且NCoR其雌激素受体作用位点与SRC⁃1相同，因此形成辅活化子⁃辅阻遏子开关，两者共同竞争与该位点结合，共同调节雌激素转录活性。NCoR分子的C端含有RID受体作，丁巍等［15］发现，NCoR在孕酮存在的情况下可以与PR形成复合物，招募PR反应元件，从而抑制黄体酮靶基因的转录。且该研究表示，乳腺癌患者NCoR表达水平上调可抑制ER所诱导癌细胞增殖。本研究发现，子宫内膜重度异常增生患者其子宫内膜组织SRC⁃1表达水平低于对照组，且其NCoR表达水平高于对照组，提示子宫内膜重度不典型增生患者其子宫内膜组织存在高水平表达，而低水平ER与SRC⁃1结合可能强化核受体活性，提高子宫内膜对雌激素的敏感性，促进子宫内膜异常增生。同时其NCoR表达水平较低，主要可能与子宫内膜重度不典型增生患者其内膜组织PR水平较低有关，可进一步下调NCoR水平，强化核受体活性，促进子宫内膜增生。

此外，本研究还发现，SRC⁃1与ER表达呈负相关，而NCoR与PR表达呈正相关，主要可能与低水平ER可激活SCR⁃1表达，而低水平PR可诱导NCoR表达水平降低有关，且高水平SRC⁃1与低水平NCoR均可介导雌激素调节，影响子宫内膜细胞生长及增殖，促进子宫内膜细胞呈浸润性生长，增加癌变风险，本研究创新点为探讨SRC⁃1和NCoR在子宫内膜重度不典型增生患者中的表达情况，为子宫内膜重度不典型增生的预后提供一个新的参考指标，并为子宫内膜重度不典型增生激素治疗提供更为有力的辅助判断指标。