血浆TSP⁃2水平与冠状动脉狭窄程度的关系
2018-07-26王竟悟艾凤英王大胜吴悠苏岩杰杨鑫泉王大新
王竟悟 艾凤英 王大胜 吴悠 苏岩杰 杨鑫泉 王大新
1扬州大学临床医学院心血管内科(江苏扬州 225001);2大连医科大学(辽宁大连 116044);3中南大学湘雅二医院(长沙 410011)
血小板反应蛋白(thrombospondins,TSPs)是三聚体调节性糖蛋白,是血小板的重要组成部分。近年来,TSPs对心血管系统的作用日益引起大家的关注。TSPs家族分为两大类,A亚组包括TSP⁃1和TSP⁃2,B亚组包括 TSP⁃3、⁃4、⁃5。研究表明,正常成人组织中TSP⁃1水平很低,但在动脉粥样硬化病变处,TSP⁃1大量表达,表明其在动脉粥样硬化性心脏病中起重要作用。而同TSP⁃1相比,我们对同属A亚组的TSP⁃2在动脉粥样硬化病变中所起到的作用的认识受到了明显限制,其与冠状动脉动脉粥样硬化病变程度之间是否具有一定相关性值得我们进行深入的探讨。本研究拟分析中国人群血浆TSP⁃2水平与冠状动脉狭窄病变程度和相关炎症细胞因子之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2017年7月1日至2017年11月30日在苏北人民医院心内科206病区住院并接受冠状动脉造影检查的患者,共106例,其中79例确诊为冠状动脉狭窄者为实验组,男55例,女24例,年龄(62.6±10.89)岁;27例冠状动脉造影正常者为对照组,男9例,女18例,年龄(58.74±8.78)岁。排除标准:年龄>80周岁;既往有明确冠心病病史,行冠脉支架植入或冠脉搭桥术者;合并CKD病史或急性肾损伤或规律血液透析者;拒绝行冠脉造影检查或造影不成功者;心肌炎、心肌病、严重主动脉瓣疾病、外周动脉疾病及结缔组织病者;中、重度心力衰竭;重度或难治性高血压;良、恶性肿瘤及肿瘤术后患者;严重心律失常、贫血、感染者;不自愿入组者和心理精神疾病患者。所有研究对象均知情同意,研究符合人体试验伦理要求。
1.2 冠状动脉造影检查 冠状动脉造影由2位资深的心导管专科医生进行,通过Gensini评分(gensini score,GS)分别对左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉等主要冠状动脉的狭窄程度进行评分计算。根据Gensini评分将实验组分为轻度狭窄组(Low组,≤12分)共27例,中度狭窄组(Medium组,12~60分)共26例,重度狭窄组(High组,≥ 60分)共26例。
1.3 血浆 TSP⁃2、MMP⁃9和 hs⁃CRP 检测 所有研究对象均于入院24 h内采集5 mL空腹静脉血于EDTA抗凝管内,立即送至江苏省苏北人民医院实验研究中心,4℃冰箱静置30 min后,以3 000 r/min离心10 min;吸取上层淡黄色血浆于1.5 mL EP管中,置-80℃冰箱冻存盒中保存待检。以酶联免疫法(ELISA法)测定各组血浆TSP⁃2、MMP9、hs⁃CRP的浓度;TSP⁃2 ELISA试剂盒购自美国RD公司,MMP9、hs⁃CRP ELISA试剂盒购自中国上海BG公司。
1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0、Graphpad prism 5和EXCEL统计软件。计量资料用均数±标准差表示,用The Shapiro⁃Will test来评价计量资料是否符合正态分布。计数资料用频数、百分构成比表示,采用χ2检验。计数资料呈正态分布且总体方差齐时,则采用独立样本t检验及单因素方差分析(one⁃way ANOVA);若计数资料不呈正态分布时,则用 the Mann⁃WhitneyUtest和 Kruskal⁃Wallis test.Spearman相关系数计算两个连续变量之间的关系;多元逐步回归分析法用于不同变量对TSP⁃2的影响评价,并对协变量进行调整;采用二元Logistic多因素回归分析冠状动脉狭窄的危险因素;采用接受器工作特征曲线(ROC曲线)评估诊断价值并计算血浆TSP⁃2诊断的截断值。依据α=0.05的检验水准,P<0.05时为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床基线资料 根据Gensini评分对106例研究参与者进行临床资料汇总,分析发现高密度脂蛋白(HDL⁃C)、脂蛋白A1(ApoA1)、左室射血分数(LVEF)和左室舒张末内径(LVd)在3组间具有统计学差异(P<0.05)。Gensini评分与总胆固醇(TC)、肌酐、中性粒细胞百分比、空腹血糖和吸烟百分率呈正相关(P<0.05)。各组间年龄、体质指数(BMI)、血压、左室收缩末内径(LVs)、左房内径(LA)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL⁃C)和平均血小板体积等均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
2.2 血浆TSP⁃2水平与Gensini评分的相关性ELISA法检测四组人群血浆中TSP⁃2的水平,血浆中TSP⁃2水平分别是(15.30±3.58)、(16.81±2.50)、(17.32±3.04)ng/mL,正常组为(13.85±2.39)ng/mL;TSP⁃2在相邻两组组间均不存在差异(P>0.05);对照组(control组)与Gensini中评分组(Medium组)开始出现统计学差异(P<0.05),而对照组与Gensini高评分组(High组)相比具有显著统计学差异(P<0.01)。线性相关分析可见血浆TSP⁃2(r=0.513 4>0,P<0.001)水平与Gensini评分之间有显著的相关性。见图1。
表1 对照组与各Gensini评分亚组间临床基线资料比较Tab.1 Baseline clinical and demographic features according to Gensini score tertiles among patients ±s
对照组组别基线资料人数(例)年龄(岁)BMI(kg/m2)高脂血症[例(%)]2型糖尿病[例(%)]收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)吸烟[例(%)]LVEF(%)LVd(mm)LVs(mm)LA(mm)实验室指标TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL⁃C(mmol/L)HDL⁃C(mmol/L)LP(a)(mg/L)ApoA1(g/L)空腹血糖(mmol/L)尿酸(μmol/L)尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)中性粒细胞百分比(%)红细胞分布宽度(fL)平均血小板体积(fL)Gensini评分Low组Medium组High组P值27 58.7±8.8 23.2±3.35 5(18.5)3(11.1)132.9±19.8 80.0±11.0 5(19.5)62.0±2.1 45.0±3.6 30.2±2.5 30.8±3.4 27 64.4±8.1 24.0±3.1 5(18.5)5(18.5)137.3±14.3 78.3±9.5 11(40.7)60.0±2.9 46.7±3.1 31.1±2.2 31.9±3.6 26 63.3±11.8 24.1±2.7 6(23.0)11(42.3)136.3±22.7 78.2±10.2 15(57.7)57.8±5.2 46.7±3.7 31.9±4.5 32.5±3.9 26 60.1±12.0 24.3±3.8 6(23.0)10(38.5)147.8±23.0 84.8±14.7 17(65.4)54.8±5.9 48.7±4.5 33.0±4.5 32.0±3.1 0.169 0.613 0.953 0.027*0.074 0.360<0.01**<0.01**0.032*0.0857 0.4379 4.4±0.7 1.6±0.8 2.4±0.7 1.3±0.4 227.0±197.2 1.4±0.3 5.5±1.0 313.9±82.1 5.8±1.2 62.3±14.8 62.2±8.7 42.8±2.6 11.1±1.0 4.2±1.0 1.7±1.0 2.4±0.9 1.2±0.3 206.3±197.9 1.3±0.3 6.3±1.9 334.7±107.5 5.9±2.4 75.3±24.6 64.1±8.4 44±4.0 11.3±1.4 4.4±1.2 2.1±1.8 2.4±0.9 1.1±0.4 217.6±183.5 1.2±0.3 6.8±2.3 329.2±64.5 5.9±1.9 81.2±23.0 69.3±8.4 41.6±2.4 11.4±0.9 5.4±2.0 2.3±2.1 3.1±1.5 1.1±0.3 266.5±216.8 1.2±0.3 7.4±3.0 351.1±101.3 5.6±1.5 84.3±20.6 68.5±12.2 43.3±3.3 11.2±1.4<0.01**0.710 0.129 0.041*0.471<0.01**0.026*0.772 0.787<0.01**0.025*0.077 0.763
2.3 血浆TSP⁃2水平与冠脉狭窄相关炎症细胞因子的相关性 MMP⁃9和hs⁃CRP是目前研究较广泛的与冠状动脉狭窄有密切关系的炎症细胞因子,ELISA法在四组人群的血浆中均能检测到MMP⁃9和hs⁃CRP。本实验结果同样也验证了随着狭窄程度的上升,血浆MMP⁃9和hs⁃CRP的含量也呈上升趋势,且具有统计学差异(P<0.05)。相关性分析显示血浆TSP⁃2与MMP⁃9(r=0.238 5,P=0.013 8)、hs⁃CRP(r=0.204 2,P=0.035 7)之间具有相关性(P<0.05)。见表2、图2。
图1 各组血浆TSP⁃2水平及TSP⁃2与Gensini评分的线性相关分析Fig.1 Plasma TSP⁃2 levels in each group and linear correlation analysis between TSP⁃2 and Gensini score
2.4 回归分析 为确定哪些因素是血浆TSP⁃2的影响因素,分别以TSP⁃2为因变量,Gensini评分、年龄、性别、BMI、是否吸烟、LVEF、LVd、LVs、LA、TG、TC、LDL⁃C、HDL⁃C、LDL⁃C、ApoA1、空腹血糖、尿酸、尿素氮、肌酐、hs⁃CRP等可能影响血浆TSP⁃2水平的因素为自变量进行多元逐步线性回归检测;Gensini评分不符合正态分布,为确定哪些因素与冠状动脉狭窄存在关联,对可能响冠状动脉狭窄Gensini评分的变量做Logstic回归分析,TSP⁃2、年龄、性别、是否吸烟、TG、TC、LDL⁃C、HDL⁃C、LDL⁃C、ApoA1、空腹血糖、尿酸、尿素氮、肌酐、hs⁃CRP为自变量。结果如下:以TSP⁃2为因变量,Gensini评分、LVEF是血浆TSP⁃2的独立预测因子,均具有统计学差异(P<0.05)。见表3。Logstic回归分析结果显示TSP⁃2、年龄、hs⁃CRP是冠状动脉狭窄病变的独立危险因素,HDL⁃C是独立保护因素,差异具有显著统计学意义(P<0.05)。见表4。
表2 对照组与各Gensini评分亚组间血浆MMP⁃9、hs⁃CRP水平比较Tab.2 Comparison of plasma MMP⁃9 and hs⁃CRP levels between control group and each Gensini score subgroup ±s
表2 对照组与各Gensini评分亚组间血浆MMP⁃9、hs⁃CRP水平比较Tab.2 Comparison of plasma MMP⁃9 and hs⁃CRP levels between control group and each Gensini score subgroup ±s
注:#,代表与Control比较,有统计学差异(P < 0.05);*,代表与Gensini≤ 12比较,有统计学差异(P<0.05);※,代表与12<Gen⁃sini<60比较,有统计学差异(P<0.05);△,代表与Gensini≥ 60比较,有统计学差异(P<0.05)
Gensini评分Control Low组Medium组High组例数27 27 26 26 MMP⁃9 8.14 ± 2.0*※△11.16±2.66#△11.09±1.93#△16.53±4.40*#※hs⁃CRP 43.65 ± 3.42*※△48.18±4.14#△50.17±6.53#△53.28±3.85*#※
表3 以TSP⁃2为因变量的多元逐步线性回归Tab.3 Multivariate stepwise linear regression with TSP⁃2 as dependent variable
2.5 诊断真实性分析(ROC曲线) 将所有研究参与者分为对照组即正常人群组和冠状动脉狭窄组做接收器工作特征曲线(receiver operator charac⁃teristic curve,ROC曲线)。曲线的横轴为“1-特异度”即假阳性率,纵轴“灵敏度”即真阳性率,为反应敏感性和特异性连续变量的综合标记物。同时,根据规定,认为AUC范围在0.5~0.7时,有较低正确性;AUC范围在0.7~0.9时,有一定正确性;AUC范围在0.9以上时,正确性较高(即AUC越接近于1,说明诊断效果越好)。结果如下:TSP⁃2的AUC为0.742,敏感度为0.532,特异性为0.852,约登指数为0.383,最佳截断值为16.17 ng/mL;hs⁃CRP的AUC为0.845,敏感度为0.759,特异性为0.889,约登指数为0.648,最佳截断值47.87 ng/mL。两者AUC值均>0.7,P<0.05,意味着两者均具有较好的正确性和较好的诊断效果。见表5、图3。
表4 以冠脉狭窄病变为因变量的logistic回归分析Tab.4 Logistic regression analysis with coronary stenosis as dependent variable
表5 ROC曲线下面积、灵敏度、特异度、约登指数和最佳截断值表Tab.5 The value of the area under the ROC curve,sensitivity,specificity,Youden index and optimal cutoff
图3 TSP⁃2和hs⁃CRP的ROC曲线图Fig.3 Receiver⁃operating characteristics(ROC)curve analysis for TSP⁃2 and hs⁃CRP
3 讨论
近年来随着对冠状动脉疾病的病理生理学研究逐渐深入,直接导致了20世纪末的人类死亡率的下降[1]。然而,CAD目前仍然是世界上最主要的死亡原因之一[2]。在发展中国家和发达国家的35岁以上人群中,1/3的人死于冠状动脉疾病,而在西方国家,这一比例甚至接近50%[3-4]。世界卫生组织预测,到2020年,全球将负担达到超过4700万残障人群[5]。但目前仍然缺乏能够对冠状动脉病变严重程度进行灵敏评估的指标。
TSP⁃2作为一种结构糖蛋白,首先,可通过与CD47的相互作用激活“抗炎”T细胞,从而阻止内皮细胞的粘附、凋亡和坏死细胞的迁移[6-7]。第二,TSP⁃2能够调节组织炎症通过限制组织损伤的免疫反应,因此,实现一个自适应效果[8]。第三,TSP⁃2可以通过调节基质活性、内皮细胞的增殖和凋亡来抑制血管生成[9]。目前关于TSP⁃2的研究成果主要有如下几个方面[10-11]:(1)血清TSP⁃2水平与心衰NYHA分级水平具有明显相关性;(2)高水平TSP⁃2是心血管事件发生的独立预测因素;(3)高水平TSP⁃2联合BNP,明显增加了心血管不良事件的发生率。可以从上述近年研究成果发现,对TSP⁃2的临床性研究一直集中与心力衰竭方面,TSP⁃2对心力衰竭终末事件的发生有良好的预测作用。因此本研究在人群纳入时考虑到心衰的影响,纳入的人群均无心力衰竭。同时,笔者目前尚未查阅到TSP⁃2与冠状动脉狭窄程度相关的临床研究性文章。
本实验结果示对照组、轻度狭窄组、中度狭窄组、重度狭窄组的血浆TSP⁃2含量虽然呈上升趋势,但组间均不存在差异性(P>0.05)。中度狭窄组与对照组相比,血浆TSP⁃2水平出现统计学差异(P<0.05),而CAD终末阶段的重度狭窄组与对照组相比,血浆TSP⁃2水平具有非常显著的差异性(P<0.001),可见血浆TSP⁃2水平对冠脉达到中、重度狭窄的情况具有较高的预测效果。对冠状动脉狭窄病变进行Logstic回归分析和对TSP⁃2进行多元逐步线性回归结果也对此也进行了佐证,冠状动脉狭窄程度越大,血浆TSP⁃2水平越高,而TSP⁃2又是冠状动脉狭窄的独立危险因素。由此可见,在冠状动脉狭窄逐步加重的过程中TSP⁃2扮演着一个怎样的角色值得我们深入的研究。同时,TSP⁃2的ROC曲线下面积为0.742,与hs⁃CRP无差异性,具有良好的准确性,说明TSP⁃2也是一具有良好临床应用前景的敏感指标。
有趣的是多元逐步线性回归结果显示左室射血分数(LVEF)与血浆TSP⁃2水平存在关联性(P<0.05),SCHROEN等[12]发现心脏负荷过重时,心肌纤维化和心脏分泌的某些基质可以维持TSP⁃2一直处于一个高水平状态。ALEXANDER等[13]同样也发现TSP⁃2与LVEF存在相关性。冠状动脉狭窄是一个缓慢的过程,在这过程中心肌缺血逐渐加重,心脏负荷也越来越重,心脏结构和功能会发生一系列的改变,在改变过程中LVEF也会受到影响,同时TSP⁃2作为血管生成、心肌细胞损伤和细胞外基质破坏的必要抑制剂,存在年龄依赖性并调节免疫和心血管重塑之间的相互关系,TSP⁃2从而和LVEF产生了关联性[14-15]。但本研究为了排除心力衰竭的干扰[11],只纳入了LVEF基本正常的人群,尽管线性回归分析左室射血分数(LVEF)与血浆TSP⁃2关联性P=0.046≈0.05,这其中的机制也值得近一步探讨。同时我们也对心脏负荷早期的指标左房内径(LA)进行了统计分析,研究结果表明LA在各组之间无差异性(P>0.05),在今后的研究中我们仍需结合心力衰竭的类型和程度进行更广泛的研究。
炎性细胞因子一直是动脉粥样硬化过程中的研究热点,其可侵蚀不稳定斑块,加重斑块的易损性[16-17]。CRP是急性时相蛋白,当机体处于一定程度的炎症反应时为阳性,当前技术已可检测出更准确、更低的hs⁃CRP浓度[18]。本研究相关性分析结果也表明TSP⁃2和hs⁃CRP存在正相关性(P< 0.05)。同时,在TSP⁃2和hs⁃CRP对判断冠状动脉的ROC曲线中,笔者发现TSP⁃2和hs⁃CRP的曲线下面积均>0.7且P<0.05,对判断冠状动脉狭窄有良好的预测能力。基质金属酶(MMPs)是最常见的一种参与基质重塑的酶;除了降解部分基质的作用外,MMPs还可以通过从基质中释放生长因子和其它的纤维化信使来促进细胞外基质的合成[19],且已被证实与冠状动脉狭窄程度存在显著相关性[20],而MMP⁃9是基质金属酶中研究最广泛的。本实验结果证实MMP⁃9与TSP⁃2之间存在相关性(P<0.05)。这也从侧面证实了血浆TSP⁃2水平与冠状动脉狭窄程度之间存在关联性。
TSP⁃1和TSP⁃2抗血管生成的功能与位于N⁃末端的裂解素重复序列有关[21]。来自该区域的小肽对血管生成只有微弱的抑制作用,然而,一种特殊的裂解素区域的七肽分子酸(D-异亮氨酸)被发现可以使抗血管生成活动增加1 000倍[22]。因而一种有效的抗血管生成的七肽ABT⁃510产生了[23]。研究表明,ABT⁃510对人是安全和可耐受的,在Ⅱ期临床研究中表现出了患者整体存活率有了适当延长,联合细胞毒性药物进行治疗能提高抗癌治疗的效率,但TSP⁃1和TSP⁃2在心血管领域的作用还没有被开发出来,在未来极具发展前景。
综上所述,血浆TSP⁃2水平与冠状动脉狭窄程度之间存在正相关性,同时也是冠状动脉狭窄的一个潜在有效的预测指标,结合其病理生理特点,TSP⁃2也是今后冠脉狭窄的一个重要治疗干预靶点。同时本实验最主要的局限性是研究人群数量较小,同时人群种族、冠脉狭窄评分标准单一、遗传背景存在差异、样本量偏小等问题,仍需笔者在今后的研究中更进一步的探讨。