CXCL13激活小胶质细胞参与瑞芬太尼诱发疼痛过敏

张熙 王光杰 张娟 薛锐

1湖北医药学院附属人民医院麻醉科（湖北十堰 442000）；2湖北医药学院附属太和医院神经内科（湖北十堰 442000）

阿片诱发的痛觉过敏（opioids⁃induced hyperal⁃gesia，OIH）是指输注阿片类药物引起的痛域降低。OIH不仅促进痛觉感知，引起痛觉异常，甚至出现慢性疼痛症状［1］。阿片诱发痛觉过敏的发生速度与阿片类药物特性密切相关，药物作用时间越短，耐受发生越迅速，瑞芬太尼是一种超短效的μ⁃受体激动剂，因其起效迅速、作用时间短。因此瑞芬太尼较其他阿片类药物发生痛觉过敏更快，而这种耐受和痛觉过敏又呈剂量依赖性［2］。但瑞芬太尼诱发的痛觉过敏机制仍不清楚，因此了解其具体发生机制仍是临床镇痛用药关注的难题。趋化因子CXC配体13（CXCL13）属于CXC趋化因子家族，已经被证明在神经损伤后产生的快速而持久的触觉和热感觉异常中，通过上调脊髓束中的炎症因子产生表达［3］。CXCL13在神经系统中存在表达，并通过激活神经胶质细胞参与神经病理性痛、炎性痛等慢性疼痛的形成与维持［4］。但CXCL13是否与瑞芬太尼诱发的痛觉过敏有关尚无定论，因此，本研究旨在观察CXCL13在瑞芬太尼诱发的痛觉过敏中的表达情况，并进一步探讨其如何参与其痛觉过敏的过程。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 选择成年健康SD大鼠（SPF级）20只，体质量200～250 g，雌雄不限，由湖北医药学院实验动物中心提供。随机分为4组，每组8只：切口痛组（C组），瑞芬太尼组（R组），NC⁃siRNA慢病毒组（NC组）和CXCL13⁃siRNA慢病毒组（CX组）。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，参照Brenman法［5］建立疼痛模型。尾静脉泵注I组：生理盐水10 μg/（kg·min），持续1 h；R组：盐酸瑞芬太尼注射液（宜昌仁福制药公司）10 μg/（kg·min），持续1 h；NC组：鞘内注射注射NC⁃siRNA慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）10 μL（108TU/mL）30 min后，尾静脉泵注瑞芬太尼10 μg/（kg·min），持续1 h；CX组：鞘内注射CXCL13⁃siRNA慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）10 μL（108TU/mL）30 min后，尾静脉泵注瑞芬太尼10 μg/（kg·min），持续1 h。

1.2 机械痛阈检测 分别于造模前1 h，术后2、6、12、24 h时采用von FreyTM动态足底触觉测量仪（UGO公司，意大利）测定大鼠机械缩足阈值（MWT）。大鼠置于金属笼（10 cm×10 cm×15 cm），适应环境20 min，处于静息状态时，开始测定，von Frey丝由下向上垂直刺激右侧足底中部皮肤，设定20 s内刺激逐渐由0升高为50 g，当出现快速缩足反应时，刺激自动停止，记录压力值，共测3次，间隔5 min，取其平均值作为大鼠机械缩足阈值（MWT）。

1.3 免疫荧光双标检测 痛阈测定结束后，麻醉下取L4～6脊髓组织常规固定，30%蔗糖脱水至沉底，冰冻连续切片（厚15 μm），加入封闭液，室温孵育30 min，PBS漂洗后，同时加入CXCL13抗体（1∶500，beyotime公司，美国）和抗大鼠NeuN抗体（1∶1 000，Millipore公司，美国），孵育，洗涤，加荧光标记二抗，室温孵育，洗涤，用50%甘油封片。激光共聚焦荧光显微镜（Zeiss，德国）观察CXCL13在神经元上的表达和小胶质细胞活化情况。

1.4 Western blot检测 CXCL13和 Iba⁃1蛋白表达 取L4～6脊髓，加组织裂解液，经冰浴匀浆后抽提总蛋白，用BCA法进行蛋白浓度定量，取上样蛋白 50 μg（20 μL），经 10%SDS⁃PAGE 凝胶电泳，转膜，室温封闭，加入β⁃actin（1∶3 000，Chemicon公司，美国）、CXCL13抗体（1∶1 000，beyotime公司，美国）和 Iba⁃1抗体（1∶1 000，beyotime公司，美国），过夜，TBST洗膜，加二抗（1：5 000，北京中杉金桥公司），室温孵育，洗膜，曝光。分光密度比值反映CXCL13和Iba⁃1的蛋白表达。

1.5 RT⁃PCR法检测CXCL13和Iba⁃1的mRNA表达 从组织样本提取总mRNA。采用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，遵循PCR引物设计原则，以GAPDH作为内参，引物由上海生物工程公司合成，序列见表1。扩增条件：94℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 20 s，共45个循环，72℃延伸10 min。计算CXCL13和Iba⁃1与内参照GAPDH的比值作为目的基因的相对表达量。

表1 CXCL13、Iba⁃1和GAPDH引物序列Tab.1 Sequences of CXCL13、Iba⁃1 and GAPDH primers

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MWT比较 四组大鼠术前1 h MWT值比较无统计学差异（P＞0.05）；与I组比较，R组、NC组和CX组术后2 h MWT值随时间增加显著下降（P＜0.05），至术后24 h时降至最低；与R组、NC组比较，CX组术后6 h MWT值显著升高（P＜0.05），并持续至术后24 h；R组与NC组MWT值在各对应时间点差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠术后不同时点MWT的比较Tab.2 The comparison of MWT value in various groups of rats（n=5） x ± s，g

2.2 免疫荧光双标表达情况 免疫荧光显示：疼痛发生时CXCL13在神经元中出现表达，瑞芬诱发痛觉过敏模型大鼠（R组）脊髓中CXCL13表达升高；CXCL13⁃siRNA慢病毒脊髓注射后（CX组）CX⁃CL13的表达明显减少；R组脊髓小胶质细胞明显活化，CX组其活化则明显减少。见图1。

图1 CXCL13在各组大鼠脊髓中的表达分布Fig.1 The expression distribution of CXCL13 in the spinal cord of various groups of rats

2.3 CXCL13和Iba⁃1蛋白表达及mRNA表达情况 与I组比较，R组、NC组的CXCL13和Iba⁃1蛋白表达及mRNA表达水平明显上调（P＜0.05）；与R组、NC组比较，CX组的CXCL13和Iba⁃1蛋白表达及mRNA表达水平显著下调（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组大鼠脊髓CXCL13、Iba⁃1蛋白表达的比较Fig.2 The comparison of expression of CXCL13 and Iba⁃1 protein in the spinal cord of various groups of rats（n=5，x ± s）

表3 各组大鼠脊髓CXCL13、Iba⁃1的mRNA表达的比较Tab.3 Comparison of mRNA expression of CXCL13 and iba⁃1 in the spinal cord of various groups of rats（n=5） ± s

表3 各组大鼠脊髓CXCL13、Iba⁃1的mRNA表达的比较Tab.3 Comparison of mRNA expression of CXCL13 and iba⁃1 in the spinal cord of various groups of rats（n=5） ± s

注：与I组比较，aP ＜0.05；与R组、NC组比较，bP＜0.05

组别I组R组NC组CX组F值P值CXCL13 1.20±0.20 1.70±0.16a 1.72±0.22a 0.36±0.11 64.955 0.000 Iba⁃1 1.54±0.11 2.54±0.18 2.58±0.26 2.00±0.16 35.300 0.000

3 讨论

围术期使用阿片药物可以加重术后痛觉过敏，约有20%的患者术后剧痛难以控制，导致术后并发症和死亡率的增加，部分患者将发展为术后慢性病理性疼痛，从而严重影响患者日后的生存质量［6］。

本实验中注射瑞芬太尼后出现疼痛灵敏性增高，持续泵注瑞芬太尼后2 h出现疼痛阈值降低，于24 h达到高峰，这与临床上瑞芬太尼诱发痛觉过敏始于麻醉苏醒后2 h，并于24～48 h达到高峰的研究基本一致［7］。

神经炎症反应的主要机制是炎症介质，包括促炎细胞因子和趋化因子，增强了外周神经系统和中枢神经系统不同区域的痛觉信号［8］。越来越多的研究发现脊髓趋化因子在神经损伤后慢性疼痛进展中的作用［9-10］。CXCL13在裸鼠脊髓神经损伤后表达增高［11］；并且CXCL13已经被证实涉及骨癌痛以及吗啡的镇痛耐受机制［12］。本研究发现切口痛组大鼠脊髓中CXCL13产生表达，并在瑞芬太尼诱导疼痛过敏组的表达被上调；BAGAEVA等［13］的研究也表明，CXCL13在健康的中枢神经系统中无表达，但在病理条件下的脑和脊髓中表达升高。在鞘内注射CXCL13⁃siRNA慢病毒后大鼠的机械痛域值显著增高，大鼠对疼痛耐受程度增强。这些结果表明CXCL13可能参与了瑞芬太尼诱导痛觉过敏。

阿片类药物吗啡引起的镇痛耐受和痛觉过敏中也发现了脊髓胶质细胞的激活［14］。本研究在瑞芬太尼诱导疼痛过敏模型中CXCL13在脊髓胶质细胞中表达较切口痛模型组增多，而在CXCL13⁃siRNA组表达减少。这提示CXCL13可能通过激活脊髓胶质细胞参与瑞芬太尼诱导的痛觉过敏。

为了进一步证实脊髓胶质细胞的激活是否参与了瑞芬太尼诱导的痛觉过敏，本研究检测了小胶质细胞特异性标记物Iba⁃1的表达，发现在瑞芬太尼诱导的痛觉过敏大鼠脊髓小胶质细胞特异性标记物Iba⁃1表达较切口痛模型组增高，但在鞘内注射CXCL13⁃siRNA慢病毒后Iba⁃1表达显著降低，表明CXCLl3的表达和小胶质细胞的活化具有同步性，这证实了CXCL13对小胶质细胞的活化是调节瑞芬太尼诱导痛觉过敏的重要环节。其作用机制可能是瑞芬太尼诱发疼痛过敏过程中神经元通过免疫反应调控小胶质细胞的活性，小胶质细胞释放的趋化因子又进一步激活小胶质细胞，使突触后脊髓背角痛觉传递神经元的敏感性和反应性增强，引起中枢敏化，导致慢性疼痛。

综上所述，CXCL13可能通过小胶质细胞的激活参与了瑞芬太尼诱发痛觉过敏，抑制CXCL13能够有效抑制瑞芬太尼诱导痛觉过敏的发生。因此，CXCL13可能成为治疗瑞芬太尼诱导痛觉过敏的有效靶点。