BLNK基因慢病毒载体构建及其稳定表达的人乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞株的筛选

肖斌 庄玉格 侯贤德 刘萍 陈建芸 孙朝晖 李林海

1中国人民解放军广州总医院检验科（广州 510010）；2南方医科大学南方医院检验系（广州 510515）

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，其组织形态复杂，种类繁多，而且乳腺癌的发病机制目前也尚未完全阐明。据全球癌症数据统计［1］，2008年全世界新发乳腺癌病例138万，占癌症死亡总数的23%，死于乳腺癌的有45.8万，占癌症死亡总数的14%。近些年来，我国乳腺癌的发病率呈上升趋势，严重影响着患者的身心健康［2］。因此，极有必要深入地探讨乳腺癌的发病机制。BLNK基因编码的B细胞连接蛋白是一种接头蛋白，在B细胞受体的信号转导过程中，其SH2结构域和SH3结构域能分别与其上下游信号蛋白的特异性结构域结合，实现上下游的信号传递，从而调节B淋巴细胞的增殖、分化、凋亡等进程；在B细胞受体信号通路过度活跃的条件下，B细胞的正常分化和凋亡可被抑制，导致B细胞异常增殖，且BCR信号通路的一部分酶可以引发染色体易位，致使免疫球蛋白基因位点发生改变，形成癌基因［3-7］。近年来围绕BLNK开展的疾病研究多集中于血液系统肿瘤和淋巴瘤，而研究显示BLNK在不同肿瘤中的生物学作用截然不同。2016年，MARCOTTE等［8］在《Cell》上首先报道了BLNK在乳腺癌中的功能。该课题组利用全基因组shRNA筛选技术在17种乳腺癌细胞中发现BLNK是一种乳腺癌驱动基因（driver gene）。而多项研究以及本课题组的前期结果（未发表）也显示：BLNK高表达于乳腺癌细胞，并显著促进乳腺癌细胞的增殖和转移，其过表达可能是造成乳腺癌发生的重要因素［9-11］，但BLNK影响乳腺癌细胞发生发展的具体机制依然有待考证。本研究构建了人BLNK基因慢病毒载体，包装病毒后感染并筛选了稳定表达BLNK的人乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞株，为进一步探讨BLNK在乳腺癌中的生物学作用提供有效的研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料 非病毒质粒3XFlag⁃BLNK、293T细胞系、MDA⁃MB⁃231细胞、慢病毒载体质粒、包膜质粒pMD2.G及包装质粒psPAX2由本实验室保存；DNA maker购自Takara公司（Cat：3427Q）；总RNA提取试剂（Cat：ER101⁃01）及 qPCR 试剂（Cat：AQ141⁃01）购自北京全式金公司；LipofectamineTM2000购自Thermo Fisher（Cat：11668027）；凝胶纯化试剂盒、TaqDNA聚合酶及dNTP、限制性内切酶购自Takara公司；ECL Western blotting试剂盒购自Thermo Fisher（Cat：WP20005）；DAPI染液购自碧云天（Cat：C1002）。

1.2 重组慢病毒BLNK过表达质粒的构建与鉴定

1.2.1 BLNK基因片段的PCR扩增 用之前构建好的非病毒质粒3XFlag⁃BLNK为模板，进行PCR扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶纯化后回收备用。

1.2.2 重组慢病毒质粒的构建与鉴定 将PCR产物与慢病毒载体进行常规的连接、转化、挑菌等分子克隆实验，重组质粒并送华大基因测序鉴定。

1.3 BLNK慢病毒的包装 转染前1 d在10 cm平皿中接种293T包装细胞，用10%FBS的DMEM培养基；包装细胞50%融合时共转染质粒pMD2.G、psPAX2以及慢病毒表达载体载体各4 μg，以及30 μL标准的脂质体转染试剂LipofectamineTM2000，同时设置慢病毒空载体FLAG⁃vector作为阴性对照；6 h后换液，加入10 mL的新鲜培养基；48 h后培养上清用0.45 μm的非硝酸纤维滤器消毒过滤，以清除细胞碎屑及污染的包装细胞，4℃暂时保存，-80℃长期保存备用。

1.4 稳定表达BLNK细胞系的建立与鉴定 感染前1 d（18 ～ 24 h），MDA⁃MB⁃231细胞铺板（10 cm）；50%融合，10 mL的含病毒上清液加入8 μg/mL的Polybrene（已配成1 000×工作液）；6 h后更换正常培养基10%FBS的DMEM；24 h后开始用浓度0.5 μg/mL puro筛选；每1～2天更换培养基（均含相同puro浓度，根据细胞死亡情况，调整puro浓度）；约1周后可挑选出稳定细胞株，获得的细胞即为BLNK MDA⁃MB⁃231细胞和 miR⁃vector MDA⁃MB⁃231细胞，在高倍镜100×视野下观察被感染细胞数及细胞状态，在荧光显微镜下观察各孔中GFP的荧光表达情况。

将感染后的细胞BLNK MDA⁃MB⁃231细胞和miR⁃vector MDA⁃MB⁃231细胞按5 × 10个/孔接种于6孔板完全培养基中，孵育24 h后，利用Trizol法提取细胞总RNA，采用miRNA反转录试剂盒将其反转录成cDNA，采用RT⁃PCR方法检测两组细胞中BLNK基因表达的情况。

1.5 Western blotting检测BLNK的表达 RIPA裂解液提取细胞总蛋白质，按BCA蛋白质定量试剂盒说明书操作测定蛋白质浓度。蛋白质样品进行SDS⁃PAGE，电转印至PVDF膜后，用50 g/L脱脂牛奶37℃封闭1 h，加以50 g/L脱脂牛奶1∶1 000稀释的抗人BLNK抗体（Abcam，Cat：ab32418），4℃过夜，TBS⁃T洗膜后，加以50 g/L脱脂牛奶1∶2 000稀释的HRP标记羊抗兔抗体，37℃温育1 h，TBS⁃T洗膜，ECL液显影［12］，GADPH作为内参蛋白定量。

2 结果

2.1 PCR扩增人BLNK基因片段 以质粒3×Flag⁃BLNK为模板，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测产物大小约为1 368 bp，与BLNK基因的理论大小一致（图1）。

2.2 重组慢病毒质粒的构建与鉴定 将重组慢病毒质粒送至华大公司测序验证，经序列比对后证实插入序列无误，表明重组慢病毒质粒构建成功。

2.3 BLNK慢病毒的包装 BLNK慢病毒载体表达质粒和慢病毒空载体质粒FLAG⁃vector与包装病毒系统质粒pMD2.G、psPAX2共同转染293T细胞，转染1周后收集上清液病毒颗粒。

图1 PCR扩增产物电泳结果Fig.1 PCR product after amplification

2.4 稳定表达BLNK细胞系的建立与鉴定 荧光显微镜观察到BLNK⁃MDA⁃MB⁃231细胞和Vector⁃MDA⁃MB⁃231细胞均带有绿色荧光（图2），且病毒所在位置与细胞核位置基本重合，表明重组慢病毒已成功感染了人乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞。重组细胞传代后，在100×显微镜下可观察到重组细胞生长情况与对照细胞基本一致，状态良好（图3）。

图2 重组慢病毒感染MDA⁃MB⁃231细胞后的荧光图Fig.2 The Fluorescent result of recombinant lentivirus infection of MDA⁃MB⁃231 cell

图3 慢病毒感染传代后的细胞形态100×Fig.3 The cell morphology after passage of lentivius infection

2.5 RT⁃qPCR和Western Blotting检测BLNK基因的表达 采用RT⁃qPCR和Western Blotting检测重组细胞和对照细胞中BLNK基因的表达情况。结果表明，与对照细胞相比，重组细胞中BLNK基因的mRNA水平及蛋白表达水平均明显升高，提示稳定表达BLNK的细胞系已构建成功（图4）。

3 讨论

BLNK是B细胞特异性的衔接蛋白［4］。BLNK的基本结构包括N末端的亮氨酸链式结构（leucine zipper motif）、脯氨酸富集区（proline⁃rich region）和C末端的SH2结构域（C⁃terminal SH2 domain）［13-14］。作为BCR与下游信号通路的连接蛋白，BLNK为BTK和PLC⁃γ2提供结合位点，以调节信号通路中下游蛋白的活性［15］。B细胞受体信号通路过度活跃，可以抑制B细胞的正常分化和凋亡，促进异常增殖［7］，而BCR信号通路的部分酶会引起染色体易位从而改变免疫球蛋白基因位点，形成致癌基因［5］。BCR与周围环境中的抗原结合后触发BCR介导的信号通路，使酪氨酸激酶和一些小分子发生突变，从而促使肿瘤细胞的形成［5］。已有研究表明BLNK能促进乳腺癌细胞的增殖和转移［11，16］，其过表达可能是导致乳腺癌发生发展的重要原因，但具体的关系尚不明确。

图4 BLNK在重组细胞中的表达Fig.4 The expression of BLNK in recombinant cell

慢病毒载体包含有包装、转染、稳定和整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的重要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒和293T细胞的协助作用下，被包装成有感染力的病毒颗粒，通过感染目的细胞，实现外源基因在目的细胞中的表达［17］。与真核表达质粒相比，重组慢病毒技术的转染效率和稳定性显著提高［18］。

为提高基因转染效率，本研究选择将3XFlag⁃BLNK基因插入慢病毒表达载体，构建重组慢病毒载体，与慢病毒包装质粒同时转染293T细胞，在细胞中进行病毒包装。用包装好的慢病毒颗粒感染人乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞，经过GFP筛选，建立MDA⁃MB⁃231慢病毒细胞株，且慢病毒颗粒感染后的MDA⁃MB⁃231细胞中BLNK稳定高表达，提示已成功运用该载体将BLNK基因整合入MDA⁃MB⁃231细胞的基因组中。

本研究成功地构建了BLNK稳定表达的乳腺癌细胞株，为从细胞和分子水平上探讨BLNK基因对乳腺癌细胞的调控作用提供了体外细胞系模型，为进一步明确乳腺癌的形成、发展及转移机制奠定了基础。